人類壽命長(zhǎng)短與衰老密切相關(guān)。機(jī)體成熟后,衰老會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而加快并出現(xiàn)生理功能不可逆轉(zhuǎn)的衰退。研究發(fā)現(xiàn),氫氣具有清除自由基、抗氧化、抗炎和抗代謝紊亂等多種生物活性。本實(shí)驗(yàn)以模式生物-秀麗隱桿線蟲研究對(duì)象,胡桃醌構(gòu)建氧化應(yīng)激模型,探究氫氣抗衰老的活性及其作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下:(1)首先以野生型秀麗線蟲為研究對(duì)象,20℃環(huán)境下生長(zhǎng),探究氫氣對(duì)N2線蟲壽命的影響。研究表明:氫氣干預(yù)后線蟲壽命最長(zhǎng)可達(dá)30h,對(duì)照組壽命最長(zhǎng)可達(dá)22h,實(shí)驗(yàn)組平均壽命和最高壽命均高于對(duì)照組。經(jīng)過(guò)富氫水處理30h后,低濃度富氫水和高濃度富氫水處理下線蟲壽命分別提高了21.4%和26.7%,同時(shí),氫氣可以有效抑制線蟲體內(nèi)脂褐素的累積。機(jī)體內(nèi)脂褐素水平的高低反應(yīng)了機(jī)體衰老的程度,隨著壽命的增加,機(jī)體內(nèi)脂褐素逐漸積累增多,通過(guò)測(cè)定脂褐素的光密度值評(píng)估脂褐素積累的程度。結(jié)果表明氫氣有效抑制線蟲體內(nèi)脂褐素的積累,并具有延緩衰老,延長(zhǎng)其壽命的效果。(2)神經(jīng)退行性疾病造成機(jī)體的損傷通常是不可逆的,隨著機(jī)體的衰老神經(jīng)系統(tǒng)功能逐漸下降。阿爾茨海默病多發(fā)于中老年人,其發(fā)生機(jī)制與神經(jīng)細(xì)胞受損出現(xiàn)炎癥進(jìn)而產(chǎn)生的氧自由基有關(guān)。有研究表明淀粉樣蛋白-β(Aβ)毒性會(huì)引發(fā)在阿爾茨海默病中出現(xiàn)的突觸丟失和隨后的神經(jīng)元退化。CL4176線蟲是一種在肌肉組織中表達(dá)人的Aβ肽的轉(zhuǎn)基因線蟲,Aβ沉積在線蟲肌肉細(xì)胞中逐漸積累顯現(xiàn)出進(jìn)行性癱瘓的表型。

該實(shí)驗(yàn)通過(guò)這一模型證實(shí)了氫氣在線蟲體內(nèi)具有抵抗淀粉樣蛋白毒性的作用,低濃度氫氣干預(yù)下的轉(zhuǎn)基因線蟲CL4176對(duì)Aβ誘導(dǎo)的癱瘓無(wú)顯著差異,高濃度氫氣干預(yù)下的轉(zhuǎn)基因線蟲CL4176表現(xiàn)出Aβ誘導(dǎo)的癱瘓延遲,表明高氫氣可以緩解β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的毒性,從而說(shuō)明氫氣具有緩解老年病阿爾茨海默病中出現(xiàn)的突觸丟失和隨后的神經(jīng)元退化的作用。因此,進(jìn)一步證明了氫氣具有抗衰老的活性。(3)近年來(lái)一些研究表明,有些物質(zhì)在延長(zhǎng)壽命的同時(shí)其生殖能力和身體生長(zhǎng)發(fā)育能力下降。該研究結(jié)果表明氫氣延長(zhǎng)線蟲壽命的同時(shí)對(duì)其總產(chǎn)卵數(shù)和體長(zhǎng)沒(méi)有影響,表明氫氣不會(huì)影響生殖能力和身體發(fā)育生長(zhǎng)。在壽命實(shí)驗(yàn)的同時(shí),觀察秀麗線蟲的運(yùn)動(dòng)能力。因?yàn)樗ダ弦鸺∪馔嘶瘜?dǎo)致線蟲運(yùn)動(dòng)能力的下降。氫氣環(huán)境培養(yǎng)線蟲15天后與對(duì)照處理組相比,氫氣組線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù)均多余對(duì)照組,差異顯著;氫氣組身體彎曲次數(shù)均多余對(duì)照組,第7天線蟲身體彎曲次數(shù)/20s由12最多增加至16差異顯著,后期無(wú)明顯差異;咽泵頻率/min第三天無(wú)明顯變化,第七天由150增加至180,差異顯著。說(shuō)明氫氣對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)能力具有積極作用,從而使線蟲更具有抗衰老的能力。(4)有研究表明,秀麗線蟲的壽命與其在外界壓力應(yīng)激中的抵抗力有關(guān)。該研究采用胡桃醌來(lái)模擬內(nèi)源性氧化應(yīng)激,該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)線蟲的存活個(gè)數(shù)發(fā)現(xiàn),在濃度為300μmol/L胡桃醌氧化應(yīng)激環(huán)境下生存13h后,對(duì)照組存活率分別為10%,試驗(yàn)組存活率分別18%和20%。經(jīng)過(guò)富氫水處理24h后,線蟲抵抗由胡桃醌誘導(dǎo)引起的氧化損傷的能力顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,氫氣能顯著提高線蟲在氧化應(yīng)激環(huán)境下的抵抗力。在胡桃醌氧化應(yīng)激的條件下胰島素通路daf-2突變體線蟲、生殖腺通路glp-1突變體線蟲存活曲線均無(wú)明顯差異,氫氣不能提高其抗氧化能力,初步說(shuō)明氫氣的抗氧化活性依賴于胰島素與生殖腺信號(hào)通路。飲食限制通路eat-2、線粒體信號(hào)通路clk-1突變體存活曲線較對(duì)照組有所延長(zhǎng),抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng),初步說(shuō)明氫氣抗氧化活性不依賴于飲食限制與線粒體信號(hào)通路。(5)線蟲抵抗氧化應(yīng)激的能力跟SOD酶與GSH-Px酶的表達(dá)水平有關(guān),提高酶的活力能夠增強(qiáng)線蟲體內(nèi)抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而延長(zhǎng)其壽命。因此,我們首先研究氫氣對(duì)線蟲體內(nèi)SOD酶和GSH-Px酶活力的影響。結(jié)果顯示,在高濃度富氫水處理下,線蟲體內(nèi)SOD酶的活力較對(duì)照組提高了24.5%,效果顯著;其他無(wú)明顯差異。初步說(shuō)明氫氣抗氧化的作用機(jī)制可能是激活了SOD酶的活力。為了檢測(cè)SOD酶活性的增強(qiáng)是否因?yàn)闅錃庹T導(dǎo)酶基因表達(dá)量的變化,進(jìn)一步探究了sod-3基因表達(dá)情況,結(jié)果表明,氫氣濃度越高sod-3::GFP的熒光強(qiáng)度越強(qiáng),差異越明顯。表明氫氣促進(jìn)sod-3基因表達(dá)量上調(diào),酶的活力增強(qiáng),從而提高線蟲抵抗氧化應(yīng)激的能力,延長(zhǎng)壽命。(6)daf-16是IIS信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因,通過(guò)試驗(yàn)氫氣對(duì)突變體線蟲daf-16壽命的影響來(lái)評(píng)估氫氣延長(zhǎng)線蟲壽命的效果與IIS信號(hào)通路有關(guān)。結(jié)果表明,氫氣不能延長(zhǎng)daf-16線蟲壽命。并且線蟲體內(nèi)daf-16表達(dá)水平上調(diào),daf-2表達(dá)水平下調(diào),表明氫氣延長(zhǎng)壽命的作用機(jī)制可能與IIS信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因daf-16和daf-2的表達(dá)水平有關(guān)。sod-3基因?yàn)檠趸瘧?yīng)激信號(hào)通路中的調(diào)控基因,sod-3基因表達(dá)上調(diào),表明氫氣可能是由于激活了通路中daf-16、sod-3、daf-2的基因表達(dá),從而具有調(diào)控抗逆性蛋白表達(dá)的功能來(lái)抵抗機(jī)體內(nèi)外對(duì)線蟲不利的因素,進(jìn)而能延緩衰老。也有很多文獻(xiàn)報(bào)道飲食限制能延長(zhǎng)線蟲壽命。因此,我們測(cè)定了飲食限制信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因eat-2基因表達(dá)水平。結(jié)果eat-2基因表達(dá)水平上升,說(shuō)明氫氣抗衰老的作用與飲食限制通路無(wú)關(guān)。