目的： 膿毒癥(sepsis)是感染因素誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是燒傷、創(chuàng)傷和大手術(shù)等的常見(jiàn)并發(fā)癥,是危重癥患者死亡首要因素。革蘭陰性菌是誘發(fā)膿毒癥的主要病原體,而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌致病的主要成分,可激活體內(nèi)免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞),發(fā)揮一系列病理生理反應(yīng)。單核／巨噬細(xì)胞是機(jī)體對(duì)抗外界有害刺激的識(shí)別細(xì)胞,是抵御外界反應(yīng)的第一道防線(xiàn),通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外活性和釋放炎癥介質(zhì),在機(jī)體對(duì)損傷或感染的炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。氫氣是自然界中最小的分子,是最簡(jiǎn)單、最富有的元素,又是無(wú)色、無(wú)嗅、無(wú)味、具有一定還原性的雙原子氣體。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等作用,對(duì)多種疾病具有治療意義。利用膿毒癥動(dòng)物模型,我們發(fā)現(xiàn)氫氣具有明顯的抗炎作用,但具體機(jī)制不清。本實(shí)驗(yàn)擬探討含氫培養(yǎng)液對(duì)LPS刺激Raw264.7巨噬細(xì)胞增殖活力和凋亡、炎癥因子釋放的影響以及相關(guān)機(jī)制。方法： 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,接種于6孔或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,3mL/孔或200μL/孔,細(xì)胞密度2×106/mL。 第一部分：含氫培養(yǎng)液對(duì)LPS所致Raw264.7細(xì)胞增殖活力和凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分組如下：Con組、Con+H2組、LPS組和LPS+H2組。Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)24h后,換成正常培養(yǎng)液或不同濃度的含氫培養(yǎng)液培養(yǎng),同時(shí)給予LPS(1μg/mL)或等量PBS (LPS溶劑)處理24h,應(yīng)用MTT法和Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力和凋亡情況。 第二部分：含氫培養(yǎng)液對(duì)LPS所致Raw264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)分組和處理同第一部分,用LPS和含氫培養(yǎng)液處理24h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10;此外,應(yīng)用飽和含氫培養(yǎng)液(0.60mmol/L)培養(yǎng)細(xì)胞,于LPS處理后0h、3h、6h、12h、24h收集細(xì)胞培養(yǎng)液,檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10。 第三部分：HO-1在含氫培養(yǎng)液調(diào)控LPS致Raw264.7炎癥反應(yīng)中的作用。實(shí)驗(yàn)分為四組：Con組、Con+H2組、LPS組和LPS+H2組。氫氣處理組用飽和含氫培養(yǎng)液(0.60mmol/L)培養(yǎng),分別于LPS處理后Oh、3h、6h、12h和24h收集細(xì)胞,測(cè)定HO-1活性和HO-1表達(dá)水平。進(jìn)一步利用HO-1特異性拮抗劑ZnPP-Ⅸ (20μmol/L),通過(guò)檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10的水平,觀察HO-1在含氫培養(yǎng)液調(diào)控炎癥反應(yīng)中的作用。
結(jié)果： 第一部分：氫氣對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明顯毒性影響(P>0.05)。含氫培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P>0.05),但可以改善LPS導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞活力情況,呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。LPS導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡,給予含氫培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞凋亡明顯減少(P<0.05)。 第二部分：LPS培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致炎癥因子釋放增加(P<0.05),促炎因子TNF-α和IL-1p在6h時(shí)到達(dá)釋放高峰,而抗炎因子IL-10和晚期促炎因子HMGB1在24h達(dá)到釋放高峰,給予不同濃度的含氫培養(yǎng)液處理均可以降低促炎炎癥因子的釋放、增加抗炎炎癥因子的釋放,0.30和0.60mmol/L的含氫培養(yǎng)液治療作用明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 第三部分：與細(xì)胞正常情況下HO-1的活性和表達(dá)相比,LPS可以誘發(fā)巨噬細(xì)胞HO-1的活性和表達(dá)(P<0.05)。飽和含氫培養(yǎng)液可以提高LPS處理的巨噬細(xì)胞HO-1的活性和表達(dá)(P<0.05),且具有時(shí)間依賴(lài)性。利用Znpp抑制HO-1的活性發(fā)現(xiàn),Znpp逆轉(zhuǎn)了含氫培養(yǎng)液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的治療作用(P<0.05),說(shuō)明Znpp抑制HO-1的活性,進(jìn)一步抑制含氫培養(yǎng)液對(duì)過(guò)度炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論： 含氫培養(yǎng)液可以減輕LPS導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞活力下降,可以減少LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡；含氫培養(yǎng)液可以減輕LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞過(guò)度炎癥反應(yīng),減少促炎細(xì)胞因子的釋放,增加抗炎因子的表達(dá),且具有濃度依賴(lài)性；HO-1在含氫培養(yǎng)液調(diào)控炎癥反應(yīng)中起重要作用。