腎結(jié)石的患病率一直在增加在全球范圍內(nèi)和在中國17個成年人中就有一人患有腎結(jié)石(1、2)。結(jié)石患者在患慢性腎臟疾病(CKD)的風(fēng)險和腎功能衰竭,進(jìn)而損害生活質(zhì)量和加重財政負(fù)擔(dān)(3,4)。因此,這對尋找潛在的治療腎結(jié)石的方法具有重要意義。
草酸鈣是腎結(jié)石最常見的成分，可與腎小管上皮細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化，進(jìn)一步促進(jìn)腎小管細(xì)胞損傷(5)。氧化應(yīng)激與對草酸鈣晶體的反應(yīng)產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)有關(guān)，可通過抗氧化劑和自由基清除劑加以改善(6)。ROS可激活炎癥小體和各種轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。過度的氧化應(yīng)激和炎癥不僅增強(qiáng)了草酸鈣晶體在管狀細(xì)胞中的沉積和保留，而且還會導(dǎo)致纖維化的發(fā)生(7)。因此，在這一領(lǐng)域探索抗氧化、抗炎、抗纖維化的有效治療方法是迫切需要的。
以往的基礎(chǔ)和臨床研究表明，氫分子在不同系統(tǒng)的多種疾病中具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗凋亡等多種生物學(xué)作用(8)。本組報道吸入氫氣可緩解乙醛酸誘導(dǎo)的小鼠草酸鈣沉積及血、尿代謝紊亂(9,10)。飲用富氫水(富氫水)代表了分子氫輸送的另一種方式。富氫水的主要優(yōu)點是它是一種便攜式、易于管理和安全的氫氣輸送方式。因此，富氫水對草酸誘導(dǎo)的腎臟損傷的潛在作用有待進(jìn)一步研究。
既往研究表明，喂食可溶草酸鹽飼料是成功的草酸鈣結(jié)晶小鼠模型，具有CKD的特征。在本研究中，建立草酸飲食引起的腎臟損傷，以確定富氫水的治療效果。RNA測序(RNA-seq)作為一種檢測轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的技術(shù)，具有定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性高、檢測范圍廣的優(yōu)點(13)。本研究采用RNA-seq分析方法，檢測飼喂正常飼料和草酸飼料的小鼠腎組織中mRNA表達(dá)譜。隨后，分析和篩選草酸飼料誘導(dǎo)腎損傷的可能途徑。這項研究的目的是為富氫水對抗草酸誘導(dǎo)的腎臟損傷的潛在機(jī)制提供新的見解。
 
一、材料和方法
1、動物實驗
6-7周齡、體重25-30 g的雄性ICR小鼠購自上海捷思捷實驗動物有限公司，讓其適應(yīng)實驗室環(huán)境1周。動物實驗方案經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)。將24只小鼠隨機(jī)分為3組:第1組(ND正常對照組，n = 8)給予正常飲食和正常飲水，連續(xù)14 d;第2組(OD結(jié)石組，n = 8)給予草酸飼糧加普通水，連續(xù)14 d;第3組(OH氫水治療組，n = 8)給予草酸飼料和富氫水，連續(xù)14 d。正常飼料(SLACOM，中國上海)為小鼠常規(guī)飼養(yǎng)飼料(P1101F)。通過在無鈣日糧(TD.95027)中添加草酸鈉(50 μmol /g)制備高草酸飼料。富氫水(氫濃度≥2.5 ppm)由氫水裝置(Nanobubble)生產(chǎn)。為了減少氫的損失，富氫水儲存在鋁袋中，每8小時更換一次。通過溫和攪拌24h脫氣富氫水產(chǎn)生常規(guī)水。
實驗結(jié)束時，所有的老鼠都被麻醉。取血，3000 rpm離心10分鐘后取血清，−80℃保存。原位心臟灌注后，立即取出右腎，并保存在−80°C。然后，切除左腎，用10%緩沖福爾馬林固定。
 
2、生化指標(biāo)的測定
用商品試劑盒測定小鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)。采用相應(yīng)試劑盒檢測小鼠血清中腎損傷分子-1 (KIM-1)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂calin (NGAL)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)水平。
 
3、腎組織學(xué)
腎標(biāo)本固定在10%緩沖福爾馬林中，石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精伊紅(HE)染色。在he染色的切片中，腎小管損傷評分按0 - 5分進(jìn)行半定量評分:0 =正常組織學(xué);1 =僅變性，無壞死;2~5分別為< 25、< 50、< 75、> 75%的上皮細(xì)胞，表現(xiàn)為壞死、變性、再生、小管擴(kuò)張、蛋白管型和間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤。腎晶體用偏光顯微鏡觀察。pizzolato染色時，將硝酸銀-過氧化氫溶液加入切片。紫外燈照射30分鐘后，用蒸餾水徹底沖洗。切片在核堅紅溶液中反染5min，常規(guī)脫水。間質(zhì)纖維化區(qū)域采用Masson三色染色，染色呈深藍(lán)色。
將在−80°C下保存的腎臟樣品制備成冷凍切片，以檢測腎臟活性氧(ROS)的生成。切片用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗2次，用20 μM二氫乙錠在37℃無光下用2ml無血清DMEM稀釋。孵育30分鐘后，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡觀察紅色熒光圖像。
 
4、免疫組織化學(xué)分析
 
5、RNA-seq分析
采用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)從正常對照組和結(jié)石組小鼠腎組織中提取總RNA。然后，用Qubit RNA檢測試劑盒分析RNA的完整性、純度和濃度。之后，用Oligo (dT)磁珠濃縮mRNA，并隨機(jī)破碎成短片段。用AMPure XP珠從模板mRNA中合成并純化雙鏈cDNA。通過end Repair Mix完成cDNA末端序列，添加poly A tail和測序連接器。純化連接產(chǎn)物并分離片段，采用PCR技術(shù)進(jìn)行cDNA文庫擴(kuò)增。最后，使用HiSeq Illumina系統(tǒng)進(jìn)行測序。
使用fastQC對原始數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行目視評價。然后使用Trimmomatic 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和過濾。采用TPM法測定基因表達(dá)水平。采用DESeq算法篩選q值< 0.05、|log2FoldChange| > 1和至少一組平均TPM值> 5的差異表達(dá)基因(DEGs)。
 
6、生物信息學(xué)分析
使用京都基因與基因組百科全書(KEGG)路徑分析，根據(jù)clusterProfiler 確定差異基因的重要路徑。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 進(jìn)行交互網(wǎng)絡(luò)的可視化探索。利用Cytoscape插件cytoHubba鑒定hub基因。
 
7、免疫印跡分析
 
8、統(tǒng)計分析
實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey后測。p值<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
 
二、結(jié)果
1、富氫水可改善草酸誘導(dǎo)的晶體沉積和小鼠腎損傷
通過對腎臟切片進(jìn)行pizzolato染色和偏振顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在飼喂高可溶性草酸鹽飼料14天的小鼠腎臟中有廣泛的草酸鈣晶體沉積。富氫水顯示腎中草酸鈣晶體較少(圖1A-C)。HE染色顯示結(jié)石組腎臟明顯改變，如腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性壞死，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，富氫水可減輕這些組織學(xué)損傷(圖1A,D)。與正常對照組相比，結(jié)石組小鼠腎臟中OPN和CD44的表達(dá)增加，而富氫水組小鼠腎臟中OPN和CD44的表達(dá)降低(圖1A,E,F)。與正常對照組相比，結(jié)石組小鼠血清SCr、BUN、KIM-1、NGAL水平均顯著升高。然而，這些生物標(biāo)志物的含量在富氫水處理后顯著降低(圖1G-J)。
 

圖1.富氫水可改善草酸誘導(dǎo)的晶體沉積和小鼠腎損傷。
 
2、富氫水可改善草酸誘導(dǎo)的小鼠炎癥和氧化應(yīng)激
在炎癥指標(biāo)方面，結(jié)石組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平高于正常對照組，富氫水組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平降低(圖2A、B)。在氧化應(yīng)激標(biāo)志物方面，結(jié)石組小鼠血清中MDA含量較正常對照組顯著升高，SOD、GAH-Px和CAT活性較正常對照組顯著降低。但在氫水治療組中，這些標(biāo)記的水平是相反的(圖2C-F)。然后分析小鼠腎臟中NOX2和NOX4蛋白的表達(dá)情況。與正常對照組相比，結(jié)石組NOX2和NOX4表達(dá)增強(qiáng)，富氫水處理下NOX2和NOX4表達(dá)下調(diào)(圖2G)。此外，高草酸飲食增加的腎臟ROS產(chǎn)生通過富氫水治療得到緩解(圖2H)。
 

圖2.富氫水可改善草酸誘導(dǎo)的小鼠炎癥和氧化應(yīng)激。
 
3、富氫水給藥減輕草酸誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化
采用Masson三色染色法測定腎膠原蛋白程度的相對含量，以反映腎纖維化程度。研究表明，富氫水治療可改善高草酸飲食引起的腎間質(zhì)纖維化(圖3A,B)。免疫組化顯示結(jié)石組小鼠腎臟中α-SMA、FN和COL IV的表達(dá)較正常對照組升高，富氫水組下調(diào)(圖3A, C-E)。同樣，western blotting顯示，富氫水處理降低了腎臟中高草酸飼料引起的α-SMA、FN和COL IV蛋白表達(dá)的增加(圖3F)。

 
圖3.富氫水可減輕草酸誘導(dǎo)的小鼠腎纖維化
 
4、RNA-seq分析和KEGG通路分析
采用RNA-seq分析比較正常對照組和結(jié)石組腎組織的基因表達(dá)譜。以q<0.05、|log2FoldChange| > 1和至少一個組的平均TPM值> 5為標(biāo)準(zhǔn)選擇DEGs。共篩選出3566個DEGs, 結(jié)石組與正常對照組之間有3091個上調(diào)的DEGs, 475個下調(diào)的DEGs，如圖直方圖、散點圖和火山圖所示(圖4A-C)。聚類熱圖顯示結(jié)石組和正常對照組的基因表達(dá)模式不同(圖4D)。所有鑒定的deg均通過ClusterProfiler R包進(jìn)行KEGG分析。KEGG分析在富集分析中識別了多種途徑，并將前50條途徑可視化(圖4E)。選擇PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路和TGF-β信號通路進(jìn)一步探討富氫水給藥對草酸誘導(dǎo)腎損傷的影響。
 

圖4.RNA-seq分析和KEGG通路分析。
 
5、富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的小鼠PI3K/AKT信號通路的激活
在PI3K/AKT信號通路中，共富集了95個DEGs，在結(jié)石組和正常對照組之間有90個DEGs表達(dá)上調(diào)，5個DEGs表達(dá)下調(diào)，聚類熱圖(圖5A)。將這95個基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)Akt1、Fn1、Trp53、Igf1、Itgb1、Jak2、Pik3r1、Nras、Hgf、Myc等10個樞紐基因(圖5B)。隨后采用western blotting檢測PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)。與正常對照組相比，結(jié)石組小鼠腎臟中PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)增強(qiáng)，富氫水組小鼠腎臟中PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)(圖5C)。同樣，免疫組化顯示，高草酸飲食導(dǎo)致腎臟中PI3K和p-AKT的表達(dá)增加，富氫水處理降低(圖5D-F)。
 

圖5.富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的小鼠PI3K/AKT信號通路的激活。
 
6、富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活
聚類熱圖顯示，與正常對照組相比，結(jié)石組NF-κB信號通路中有43個DEGs富集，且這些基因均上調(diào)(圖6A)。將這43個基因通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建一個PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)8個hub基因，包括Myd88、Tlr4、Cd40、Traf3、Rela、Tnfrsf1a、Il1b、Nfkbia(圖6B)。然后通過免疫組織化學(xué)和western blotting檢測NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，結(jié)石組NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、IL-1β表達(dá)水平均高于正常對照組。但在氫水治療組中這些分子的表達(dá)水平相反(圖6C)。免疫組化還提示，富氫水處理可抑制高草酸飼料誘導(dǎo)的NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3和IL-1β表達(dá)的增加(圖6D-H)。
 

圖6.富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活。
 
7、富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的TGF-β信號通路的激活
聚類熱圖顯示，TGF-β信號通路中共富集了25個DEGs，且結(jié)石組中這些基因均較正常對照組上調(diào)(圖7A)。然后將這25個基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)8個hub基因，包括Smad3、Tgfbr2、Tgfb1、Tgfbr1、Tgfb3、Tgfb2、Acvr1和Bmpr1a(圖7B)。western blotting檢測TGF-β信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，結(jié)石組TGF-β、TGF-β ri、TGF-β rii、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)水平升高，并隨富氫水處理而下調(diào)(圖7C)。同樣，免疫組化顯示富氫水處理可降低高草酸飼料引起的TGF-β、p-Smad2和p-Smad3表達(dá)升高(圖7D-G)。
 

圖7.富氫水可抑制草酸誘導(dǎo)的TGF-β信號通路的激活。
 
三、討論
 
 
法。既往研究表明，導(dǎo)致腎結(jié)石形成的病理生理機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化。分子氫可作為細(xì)胞和器官重要的生理調(diào)節(jié)因子，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等保護(hù)作用(8)。我們通過喂食可溶性草酸飼料建立了小鼠草酸鈣模型，并證明富氫水可以減輕小鼠草酸鈣晶體沉積和腎損傷。
研究證實，ROS過量產(chǎn)生和抗氧化劑減少導(dǎo)致的氧化應(yīng)激參與了草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷，這在腎結(jié)石的形成中發(fā)揮了重要作用(6,7)。我們發(fā)現(xiàn)，富氫水可通過降低MDA含量、提高SOD、GSH-Px和CAT水平來緩解草酸飼料誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。此外，富氫水也降低了腎組織中ROS的生成。ROS過量產(chǎn)生可激活PI3K/AKT和NF-κB信號通路，進(jìn)一步加重腎損傷(15)。
PI3K/AKT通路參與了許多關(guān)鍵的細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖、凋亡和自噬(16)。由ROS等條件激活的PI3K可催化膜磷脂磷脂酰肌醇4,5 -二磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5 -三磷酸(PIP3)。PIP3磷酸化并激活A(yù)KT，從而促進(jìn)下游靶基因的激活和轉(zhuǎn)錄，如糖原合成酶激酶3β (GSK-3β)、哺乳動物雷帕霉素靶基因(mTOR)、Snail和NF-κB(17-19)。有研究表明PI3K/AKT的激活可以誘導(dǎo)GSK-3β的磷酸化和Snail的上調(diào)，這可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的激活和基質(zhì)生產(chǎn)的積累在梗阻的腎臟(20)。此前的一項研究發(fā)現(xiàn)，在草酸鈣小鼠模型中，乙二醇灌胃可激活PI3K/AKT信號通路，PI3K/AKT通路失活抑制草酸鈣晶體沉積和腎臟上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)展(21)。然而，另一項研究表明，miR-155通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活自噬，促進(jìn)草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷(22)。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)草酸飲食激活PI3K/AKT通路，富氫水抑制PI3K/AKT通路。因此，我們推測富氫水可能通過抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路來改善草酸誘導(dǎo)的腎損傷。
轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在一系列細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用，包括炎癥、細(xì)胞粘附、免疫、分化、增殖和凋亡(23)。NF-κB通路在響應(yīng)氧化應(yīng)激和其他條件時被觸發(fā)，然后NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)TNF-α、IL-1β和單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)的轉(zhuǎn)錄(24)。NLRP3炎性小體在IL-1β成熟和炎癥中起著關(guān)鍵作用。一方面，NLRP3炎性小體可加速NF-κB活化，促進(jìn)NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(25)。另一方面，NF-κB又可以通過與NLRP3啟動子結(jié)合而促進(jìn)NLRP3的轉(zhuǎn)錄(26)。既往研究表明，在草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎損傷中，NF-κB和NLRP3炎性小體通路被激活，炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。此外，抑制NF-κB和NLRP3炎癥小體可減少炎癥介質(zhì)的釋放，改善草酸鈣晶體誘導(dǎo)的腎臟炎癥(27,28)。此外，已經(jīng)證明草酸鹽通過激活NF-κB在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)OPN的表達(dá)(29)。OPN作為結(jié)石基質(zhì)的主要有機(jī)成分，通過與草酸鈣晶體的受體CD44結(jié)合，促進(jìn)草酸鈣晶體與管狀細(xì)胞表面的粘附(30)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高草酸飼料喂養(yǎng)的小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平上調(diào)，腎組織中OPN和CD44的表達(dá)增加，NF-κB通路被激活。人權(quán)觀察行政部門改善了這些情況。因此，我們假設(shè)富氫水可以通過抑制NF-κB信號通路來緩解草酸誘導(dǎo)的腎臟炎癥。
結(jié)石形成過程中過度的氧化應(yīng)激和炎癥不可避免地促進(jìn)腎小管細(xì)胞EMT和腎纖維化(31)。TGF-β是一種在腎臟疾病中發(fā)現(xiàn)的促纖維化細(xì)胞因子，它誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化(32)。TGF-β/Smad信號通路是進(jìn)展性腎纖維化的主要途徑。有研究表明，Smad2和Smad3在CKD患者和動物模型的纖維化腎臟中被激活(33)。同樣，我們之前的研究報道了TGF-β/Smad通路在腹腔注射乙醛酸鹽的草酸鈣小鼠模型中被激活，導(dǎo)致EMT和腎纖維化(34)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)草酸飼料增加了膠原含量和成纖維細(xì)胞因子的表達(dá)，激活了TGF-β/Smad通路。人權(quán)觀察的管理可以改善這些條件。因此，我們推測富氫水可以通過抑制TGF-β/Smad信號通路來改善草酸誘導(dǎo)的腎纖維化。
基于以上分析，總結(jié)富氫水對草酸誘導(dǎo)的腎損傷的可能機(jī)制(圖8)。高草酸飼料誘導(dǎo)的草酸鈣晶體增加激活NADPH氧化酶，增加腎臟ROS的產(chǎn)生。ROS可進(jìn)一步激活PI3K/AKT、NF-κB、TGF-β等通路，增加炎癥因子的產(chǎn)生和膠原沉積，促進(jìn)炎癥和纖維化。富氫水可能通過抑制PI3K/AKT、NF-κB和TGF-β信號通路，改善氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化，從而緩解草酸誘導(dǎo)的腎損傷。
 
全文摘要圖
 

 
圖8.富氫水對草酸誘導(dǎo)腎損傷的作用示意圖。高草酸飼料誘導(dǎo)的草酸鈣晶體增加激活NADPH氧化酶，增加腎臟ROS的產(chǎn)生。ROS可進(jìn)一步激活PI3K/AKT、NF-κB、TGF-β等通路，增加炎癥因子的產(chǎn)生和膠原沉積，促進(jìn)炎癥和纖維化。富氫水可能通過抑制PI3K/AKT、NF-κB和TGF-β信號通路，改善氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化，從而緩解草酸誘導(dǎo)的腎損傷。