目的:膿毒癥是由病原引起的全身炎癥反應綜合征,其發(fā)病率及病死率逐年增高,然而,目前并沒有針對膿毒癥的有效治療手段。肝臟在膿毒癥的免疫與代謝等方面都發(fā)揮重要作用,然而膿毒癥早期就會出現(xiàn)肝損傷,可以直接導致膿毒癥患者病情進展或死亡,而減輕肝臟損傷的治療手段可以降低膿毒癥的發(fā)病率及病死率。線粒體是為機體提供能量的重要細胞器,線粒體損傷或功能失調(diào)參與膿毒癥的發(fā)病機制。在膿毒癥患者中,重要臟器的線粒體功能損傷會影響細胞能量合成,然后導致多器官衰竭。線粒體自噬（mitophagy）,作為一種特殊的選擇性自噬,是調(diào)節(jié)各器官的線粒體數(shù)量以及質量的基本生理過程。FUNDC1（Fun14domain-containing protein 1）是一種近期發(fā)現(xiàn)的位于線粒體外膜的線粒體自噬受體,在低氧或氧化應激等條件下介導線粒體自噬的發(fā)生。氫氣分子,作為一種特殊的抗氧化劑,至今為止被發(fā)現(xiàn)可以有效治療70多種疾病。本課題組經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)氫氣吸入或富氫液可以有效改善膿毒癥或膿毒癥導致的臟器損傷,包括肝臟、肺臟、大腦以及腎臟等,然而具體的作用機制尚未研究清楚。本研究的主要目的是探討FUNDC1介導的線粒體自噬在膿毒癥引起的肝損傷中的發(fā)病機制中,以及在氫氣吸入改善膿毒癥小鼠肝損傷中發(fā)揮的作用。
方法:成年雄性ICR小鼠被隨機分為5組:假手術組（Sham組）,膿毒癥組（CLP組）,膿毒癥+短肽P組（CLP+peptide P組）,膿毒癥+氫氣吸入組（CLP+H2組）和膿毒癥+氫氣吸入+短肽P組（CLP+H2+peptide P組）。CLP組小鼠采用盲腸遠端結扎穿法（CLP）建立小鼠膿毒癥模型,于CLP術前24h經(jīng)小鼠腹腔注射FUNDC1抑制劑——短肽P（1 mg/kg）,并于術后1h吸入2%氫氣3h。在氫氣吸入后以及停止氫氣吸入后分別檢測各組小鼠動脈血及靜脈血的氫氣濃度;記錄各組小鼠第1天至第7天的生存率;于假手術或CLP術后6h,取各組小鼠靜脈血,檢測小鼠血清ALT、AST濃度;取小鼠肝臟組織,觀察肝組織病理學形態(tài);Western blot法檢測各組小鼠肝組織FUNDC1、p-18-FUNDC1、P62、LC3BII、caspase-1的表達水平;免疫共沉淀法檢測小鼠肝組織FUNDC1與LC3BII結合水平;提取各組小鼠肝組織線粒體,檢測線粒體呼吸控制率（RCR）。結果:小鼠動脈血及靜脈血氫氣濃度在氫氣吸入后迅速上升并保持穩(wěn)定水平,在氫氣停止吸入后迅速下降;CLP組小鼠肝組織FUNDC1和p-18-FUNDC1的表達水平降低（P<0.05）,氫氣吸入使其表達水平進一步下降（P<0.05）;免疫共沉淀結果顯示,膿毒癥組小鼠肝組織FUNDC1與LC3BⅡ的結合水平增加,氫氣吸入進一步提高其結合水平,而短肽P可以有效降低FUNDC1與LC3BⅡ的結合水平;CLP組小鼠7天生存率明顯降低（P<0.05）,氫氣吸入使小鼠7天生存率顯著提高（P<0.05）,然而CLP+peptide P組和CLP+H2+peptide P組小鼠7天生存率沒有明顯差異（P>0.05）;肝臟功能方面,CLP組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病理損傷,血清ALT以及AST濃度明顯增高（P<0.05）;氫氣吸入減輕肝組織病理損傷程度并降低血清ALT及AST濃度（P<0.05）,然而CLP+peptide P組和CLP+H2+peptide P組無顯著差異（P>0.05）;線粒體功能方面,CLP組小鼠肝組織線粒體RCR明顯減低（P<0.05）,氫氣吸入使RCR顯著提高（P<0.05）,CLP+peptide P組和CLP+H2+peptide P組無顯著差異（P>0.05）;自噬相關蛋白——P62,LC3B II,Tim23以及caspase-1的表達水平顯示,CLP組小鼠肝組織線粒體自噬水平提高（P<0.05）,氫氣吸入使其水平進一步升高（P<0.05）,而這些蛋白的表達水平在CLP+peptide P組和CLP+H2+peptide P組沒有顯著差異（P>0.05）。
結論:上述結果表明,膿毒癥小鼠7天生存率顯著下降,肝組織損傷明顯,肝組織線粒體呼吸功能障礙。根據(jù)肝組織中FUNDC1的表達下降以及自噬相關蛋白的變化情況,表明膿毒癥時FUNDC1介導的線粒體自噬水平增高。而經(jīng)2%氫氣吸入后可以明顯提高膿毒癥小鼠7天生存率,改善小鼠肝臟功能,改善膿毒癥小鼠肝臟線粒體呼吸功能,同時2%氫氣吸入后進一步提高FUNDC1介導的線粒體自噬水平。此外,應用FUNDC1的抑制劑——短肽P,可以有效阻斷FUNDC1與LC3BⅡ的結合并降低吸入氫氣后膿毒癥小鼠肝組織FUNDC1介導的線粒體自噬水平,從而阻斷了氫氣吸入改善膿毒癥小鼠肝臟損傷的作用。上述結果表明,FUNDC1介導的線粒體自噬參與膿毒癥肝損傷的發(fā)病機制;2%氫氣吸入可以通過提高線粒體自噬水平來改善膿毒癥引起的肝臟損傷;抑制FUNDC1介導的線粒體自噬可以阻斷氫氣改善膿毒癥肝損傷的治療作用,說明是FUNDC1介導的線粒體自噬是氫氣改善膿毒癥肝損傷的可能分子機制之一。