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論文概述來自南方醫(yī)科大學(xué)東莞醫(yī)院等單位。作者：Yan H, Fan M, Liu H, Xiao T, Han D, Che R, Zhang W, Zhou X, Wang J, Zhang C, Yang X, Zhang J, Li Z.

 

通過細(xì)菌產(chǎn)生氫氣，解決氫氣難以在體內(nèi)持續(xù)停留的困難，一直有學(xué)者進(jìn)行這方面探索。 2009 年哈佛大學(xué)學(xué)者補(bǔ)充產(chǎn)氫氣細(xì)菌預(yù)防肝臟炎癥，后來更多學(xué)者利用正常腸道內(nèi)產(chǎn)氫氣菌，給小腸不消化碳水化合物，激活腸道內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)氫氣的潛力。發(fā)現(xiàn)對(duì)某些疾病具有治療作用。我們課題組也進(jìn)行類似研究，利用乳果糖增加腸道細(xì)菌產(chǎn)氫氣，預(yù)防腦缺血作用。日本學(xué)者有利用難消化淀粉飼料，實(shí)現(xiàn)預(yù)防代謝綜合征的作用。最近有學(xué)者通過給動(dòng)物補(bǔ)充光合作用產(chǎn)氫氣菌，結(jié)合光照增加細(xì)菌產(chǎn)氫氣，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌產(chǎn)生的氫氣能提高動(dòng)物抗腫瘤免疫功能，這一策略為氫氣預(yù)防癌癥增加了新手段，也在氫氣抗腫瘤作用方面增加了新證據(jù)。

 

作為自然界中最輕的氣體，氫氣的生物效應(yīng)引起了廣泛的關(guān)注。早在1975年，Dole等人就發(fā)現(xiàn)氫氣可以抑制鱗狀細(xì)胞癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。氫氣具有生物還原特性，被發(fā)現(xiàn)在某些氧化應(yīng)激和炎癥疾病中具有良好的治療作用。腫瘤細(xì)胞中ROS處于高度平衡狀態(tài)。氫氣可以與ROS中的·OH等劇毒自由基發(fā)生反應(yīng)，破壞癌細(xì)胞中ROS的穩(wěn)態(tài)平衡，引起氧化還原應(yīng)激。此外，與化學(xué)藥物不同，氫氣是安全無毒的。因此，近年來氫療法受到越來越多的關(guān)注。He等合成了一系列金屬鈀化合物，用于存儲(chǔ)和生產(chǎn)用于腫瘤氫氣治療的氫。此外，利用腫瘤酸性微環(huán)境如Mg、Fe納米顆粒作為還原劑來制氫的其他策略也被制備出來。然而，這些策略受到非生物相容性材料的限制，難以實(shí)現(xiàn)氫氣的長(zhǎng)期釋放。因此，制定新的長(zhǎng)期制氫策略是提高氫治療效果的關(guān)鍵。

 

近年來，利用細(xì)菌等微生物作為活載體和治療疾病的藥物受到了廣泛關(guān)注。例如鼠傷寒S. typhimurium和梭狀芽胞桿菌已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療。然而，上述細(xì)菌通常是有毒的，需要復(fù)雜的排毒程序。此外，應(yīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建釋放工程菌的抗腫瘤藥物。PSB是一種兼性厭氧細(xì)菌，可在光照和缺氧環(huán)境中繁殖。我們之前的工作是利用無毒的PSB作為低氧靶向光熱劑用于腫瘤治療[34]。更有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)PSB在光合作用過程中會(huì)釋放出氫氣作為產(chǎn)物。在光照射下，PSB的葉綠素和類胡蘿卜素捕獲光子并傳遞到光合系統(tǒng)。氫是由氫化酶和氮化酶[37]共同作用產(chǎn)生的。此外，我們之前的工作已經(jīng)證明PSB作為一種天然細(xì)菌可以增加CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而刺激免疫反應(yīng)[34]。因此，我們認(rèn)為PSB具有良好的缺氧能力和光趨化性，是腫瘤缺氧情況下原位和長(zhǎng)期產(chǎn)氫的良好“儲(chǔ)氫容器”。

 

受此啟發(fā)，本研究開發(fā)出具有長(zhǎng)期釋氫能力的PSB用于癌癥治療。PSB自主定位于缺氧區(qū)，在氙燈照射下連續(xù)釋放氫氣。氫氣擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，引起氧化應(yīng)激，殺死腫瘤細(xì)胞。凋亡細(xì)胞釋放抗原激活樹突狀細(xì)胞(dc)，刺激免疫反應(yīng)。更有趣的是，由于化療總是誘導(dǎo)PD-L1上調(diào)，誘導(dǎo)免疫逃逸，我們發(fā)現(xiàn)基于psb的治療并沒有誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)增加，從而增強(qiáng)腫瘤的免疫治療(圖1)。因此，氫治療與自激活免疫治療相結(jié)合為癌癥治療提供了一種新的策略。

 

在體氫治療療效評(píng)價(jià)

 

對(duì)小鼠進(jìn)行熒光成像以評(píng)估PSB的生物安全性。PSB用RhB標(biāo)記后注射給小鼠?？梢奝SB主要分布在腫瘤部位保留，未向其他器官擴(kuò)散。此外還驗(yàn)證了PSB的體內(nèi)代謝。結(jié)果表明:第7天未觀察到PSB的熒光。通過血液生化和血常規(guī)檢測(cè)，證實(shí)PSB無毒。監(jiān)測(cè)小鼠30天體重也表明其生物安全性。在證明其安全性后，研究氫氣在體內(nèi)的治療效果。建立MCF-7荷瘤小鼠模型(圖4A)。荷瘤小鼠隨機(jī)分為PBS、PBS + L、PSB、PSB + L組。每7 d注射一次，2 d光照一次，持續(xù)21 d。記錄腫瘤圖像(圖4B)及其權(quán)重(圖4C)。21 d內(nèi)小鼠體重穩(wěn)定增長(zhǎng)。每2天記錄腫瘤體積。如圖4D所示，PSB + L組能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。與PBS組比較，PSB組腫瘤體積略有減小。這可能是因?yàn)镻SB會(huì)刺激免疫反應(yīng)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。21 d后處死小鼠，取腫瘤組織及主要臟器進(jìn)行H&E染色等組織學(xué)分析。如圖4E所示，PSB組腫瘤細(xì)胞輕度受損。PSB + L組腫瘤細(xì)胞壞死較多，其余兩組腫瘤細(xì)胞損傷較小。對(duì)主要臟器進(jìn)行H&E染色，發(fā)現(xiàn)四組處理均未對(duì)主要臟器造成損傷。TUNEL結(jié)果也顯示PSB + L引起更嚴(yán)重的癌細(xì)胞凋亡(圖4F)。我們的研究結(jié)果表明，氫氣療法對(duì)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)有良好的治療效果。通過測(cè)量腫瘤組織中Caspase-3和細(xì)胞色素C (Cytochrome C, Cytc)的含量，發(fā)現(xiàn)PSB + L組的損傷含量明顯高于PBS組。結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，提示氫治療可通過上調(diào)Caspase-3等凋亡蛋白引起細(xì)胞凋亡。

 

我們成功地將PSB作為一種微生物制氫劑用于腫瘤靶向制氫和免疫治療。PSB在可見光下可以通過光合作用持續(xù)釋放氫氣。結(jié)果表明，氫氣在體內(nèi)外均有較好的治療效果。有趣的是，由于PSB的存在，PD-L1的水平不會(huì)上調(diào)，這有助于增加免疫治療，減少免疫逃逸。因此，氫療法與自激活免疫療法的結(jié)合為癌癥治療提供了一種新的策略。