研究目的探索一種新的給氫方法——尾靜脈氫氣注射的安全劑量并測量血液及肝組織中的氫濃度;探討這種新的給氫方式對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的治療效果,并在此基礎(chǔ)上研究其可能的機制,從而為氫氣醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步推廣提供理論依據(jù)。
材料和方法第一部分:首先,以正常wistar大鼠為研究對象,采用急性毒理實驗Bliss法,每組分別經(jīng)尾靜脈勻速注射不同劑量氫氣,觀察14天后大鼠的急性毒性指標(biāo)(死亡和存活情況),根據(jù)最大非致死劑量LD0和絕對致死劑量LD100逐步確定尾靜脈注射H2合適受試劑量范圍并計算大鼠尾靜脈注射氫氣的半數(shù)致死量LD50;其次,根據(jù)亞急性毒理實驗原理,將大鼠隨機分為空白組、H2組和N2組,以氫氣小于LD0的2 mL·kg-115s-1(即15秒內(nèi)按照每公斤體重2毫升的劑量勻速注射,下同)為受試劑量,通過生物機能信息采集系統(tǒng)、血氣分析儀及小動物超聲系統(tǒng)測定亞急性毒性指標(biāo)(心率和呼吸頻率、平均肺動脈壓、血氣分析結(jié)果、三尖瓣區(qū)收縮期未反流及肺動脈收縮壓)來評估2 mL·kg-115s-1尾靜脈注射H2的安全性;最后,采用1 mL·kg-115s-1的劑量通過Clark型氫微傳感器測量血液中的即刻氫濃度和肝組織中的動態(tài)氫濃度。

第二部分:建立wistar大鼠CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型,分為對照組、治療組和模型組,第4周開始,治療組每日尾靜脈注射氫氣1 mL·kg-115s-1,對照組與模型組大鼠尾靜脈注射相應(yīng)體積的等滲生理鹽水。治療結(jié)束后檢測血清肝功能指標(biāo)(ALT、AST);肝組織的病理學(xué)觀察:HE染色進(jìn)行半定量觀察肝細(xì)胞變性程度,Masson染色進(jìn)行各組肝纖維化膠原半定量分析和肝纖維化分期Ishak評分,免疫組化法觀察COL1 α 1在肝組織的表達(dá)。采用GSH/GSSG、SOD、MDA蛋白活性檢測試劑盒檢測三組大鼠肝臟組織內(nèi)氧化應(yīng)激損傷水平。實時定量PCR測定大鼠肝組織TGF β 1、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)平。Western Blot測定大鼠肝組織TGF β 1蛋白表達(dá)水平。

第三部分:采用來源于第二部分的空白組、模型組和氫氣組大鼠肝組織樣本進(jìn)行基于QE的代謝組學(xué)分析。根據(jù)代謝組學(xué)的正離子差異代謝物的層次聚類分析線索,對三組樣本的星狀細(xì)胞的Vitamin A脂滴進(jìn)行透射電鏡的定性定位觀察,并進(jìn)一步用Western Blot測定三組大鼠肝組織自噬指標(biāo)LC3B的表達(dá)水平。研究結(jié)果1.尾靜脈注射氫氣的 LD50為 5.81 mL·kg-115s-1(95%CI:5.28-6.26 mL·kg-1)。2 mL·kg-115s-1的氫氣尾靜脈注射劑量小于LD0。2.2 mL·kg-115s-1尾靜脈注射劑量的亞急性終點指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果表明,N2組的mPAP水平(P<0.01)、心率和呼吸頻率(P<0.05)均顯著增加,而H2組與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義;血氣分析結(jié)果N2組出現(xiàn)了明顯的低氧血癥、而H2組未出現(xiàn)。超高分辨率多模小動物超聲光聲成像系統(tǒng)結(jié)果顯示,空白組及H2組在尾靜脈注射后三尖瓣區(qū)收縮期未探及明顯反流,CWD測量肺動脈收縮壓無明顯升高:N2組收縮期三尖瓣口出現(xiàn)明顯的反流信號,同時,CWD測量顯示三尖瓣口反流壓差較靜息狀態(tài)下明顯增加,提示存在肺動脈栓塞。3.1 mL·kg-1 15s-1的劑量氫氣尾靜脈注射后,在血液和肝臟中同時并且即刻檢測到了氫濃度:即刻濃度結(jié)果是血液37.6±3.7μmol/L,肝組織24.3±2.0 μmol/L。肝臟中的氫濃度逐步上升,在20分鐘左右達(dá)到峰值60.6±0.5 μ mol/L。1 mL·kg-115s-1的劑量尾靜脈注射后氫氣的半衰期是t1/2=0.6801 h=40.81 min。

4.光鏡下顯示,尾靜脈氫氣治療組炎性細(xì)胞沉積減少,肝細(xì)胞變性、水腫及壞死減輕;纖維組織增生減輕,部分大鼠纖維間隔減少,尤其匯管-匯管橋接纖維化和匯管-中央橋接纖維化改善明顯,膠原面積和Ishak評分氫氣治療組低于模型組(P<0.05)。氫氣治療組COL1α1陽性染色區(qū)域較模型組減少(P<0.05)。
5.與正常對照組相比,模型組抗氧化因子GSH、SOD蛋白活性低于正常組(P<0.01),脂質(zhì)損傷的指標(biāo)MDA的水平高于正常組(P<0.01);氫氣治療組肝臟組織內(nèi)GSH的水平和SOD蛋白活性相對于模型組增加(P<0.05),MDA的水平相對于模型組降低(P<0.05)。
6.模型組大鼠肝組織TGF-β1及TGF-β 1相關(guān)信號傳導(dǎo)因子Smad3的mRNA表達(dá)水平較對正常照組顯著升高(P<0.01),而氫氣治療組肝組織TGF-β 1和Smad3的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05);Smad7 mRNA檢測,模型組低于正常組(P<0.01);氫氣治療組與模型組比較升高(P<0.05)。模型組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01);而尾靜脈注射氫氣治療組大鼠肝組織TGF-β 1蛋白表達(dá)受到抑制,顯著低于模型組(P<0.05)。
7.正離子的差異代謝物的層次聚類分析結(jié)果表明,維生素A(Vitamin A)含量在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組中下降,經(jīng)尾靜脈氫氣注射治療后有所恢復(fù)。
8.電鏡觀察肝組織星狀細(xì)胞:相對空白組,模型組胞體增大、數(shù)量增多、維生素A脂滴減少。氫氣尾靜脈注射治療組維生素A脂滴有所恢復(fù)。
9.模型組大鼠肝組織LC3BⅡ相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.01);而尾靜脈注射氫氣治療組大鼠肝組織LC3BⅡ相對表達(dá)量受到抑制,顯著低于模型組(P<0.05)。
研究結(jié)論一定劑量和一定注射速度下(如1 mL·kg-11 5s-1)大鼠尾靜脈注射氫氣是安全的,并且能迅速在體內(nèi)達(dá)到常用的治療濃度。用這種新的給氫方法能夠減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化,其可能機制是通過降低大鼠CCl4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平,從而有效抑制肝組織自噬,進(jìn)而減少Vitamin A脂滴的丟失來調(diào)控TGF-β1、Smad3、Smad7的表達(dá),最終維持星狀細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、減輕肝纖維化。這些結(jié)果表明,尾靜脈注射氫氣可以作為一種安全有效的治療方法,可以為肝纖維化的治療提供了新的科學(xué)依據(jù)。