一、研究背景與目的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特殊表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA在歐美國家發(fā)病率高達(dá)0.5-2.0%,而在我國其發(fā)病率也達(dá)到了0.32-0.38%。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,受多種因素的影響,這些因素導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)失衡和過度的炎癥反應(yīng),從而引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)參與了RA的發(fā)病過程,對RA病理機(jī)制影響較大。RA的氧化損傷主要由ROS和RNS所致,它們是機(jī)體在新陳代謝過程中生成的有害自由基。OS可引起RA患者體內(nèi)的氧化標(biāo)記物如丙二醛(malondialdehyde,MDA)、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)、蛋白羰基(protein carbonyl)等水平升高。OS還能激活經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路。OS也可以改變谷胱甘肽(GSH)的氧化還原狀態(tài),促使NF-κB抑制因子(IκB)失活,進(jìn)而異位到胞核內(nèi)。氫氣(Hydrogen,H2)是自然界廣泛存在的無色、無味的氣體。其具有選擇性抗氧化作用,可選擇性中和ROS和RNS。但是,氫氣具體選擇性抗氧化作用機(jī)制目前仍不清楚,其影響發(fā)揮樞紐調(diào)節(jié)作用的上游分子也并不了解。和炎癥關(guān)系密切的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB),與細(xì)胞增殖、凋亡緊密聯(lián)系的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs),與成纖維細(xì)胞強(qiáng)效的趨化因子-轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factorβ1,TGF-β1),這些都是目前知道的氫氣抗氧化應(yīng)激途徑中的發(fā)揮重要作用的因子。Keap1/Nrf2/ARE信號通路是機(jī)體在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要通路,是近幾年抗氧化研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)通道。氫氣可以通過Nrf2發(fā)揮其選擇性抗氧化的作用,但是氫氣是通過哪種途徑誘導(dǎo)Nrf2產(chǎn)生效應(yīng)呢,這個具體的機(jī)制還是目前氫氣醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。因?yàn)闅錃獾倪x擇性抗氧化作用,所以氫氣也被應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療上。國外學(xué)者報(bào)道了在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中,氫氣治療后關(guān)節(jié)活動度評分(Disease activityscore-28,DAS28)和血液中的炎癥性指標(biāo)都有了明顯的改善。但是氫氣對于成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗氧化作用如何,及其對FLS增殖、凋亡及其相關(guān)的信號的信號通道的影響未見報(bào)道。此外,氫氣通過何種信號通道對FLS發(fā)生作用也未見報(bào)道,其與MAPK、NF-κB等信號因子有無關(guān)系尚不明確。而氫氣作用于氧化應(yīng)激疾病中的重要的抗氧化信號通道Nrf2,是否也參與了其對RA疾病的抑制過程也需要進(jìn)一步研究。
二、研究內(nèi)容與方法我們利用異種II型膠原乳劑,在小鼠背部、尾部多點(diǎn)皮下注射,建立CIA小鼠模型。通過形態(tài)學(xué)觀察小鼠足部、尾部的表現(xiàn),以評價(jià)建模的好壞。通過AI評分、形態(tài)學(xué)和病理學(xué)觀察,以評價(jià)氫氣對CIA小鼠模型類風(fēng)濕病情緩解的情況。選用MH7A類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞,通過雙氧水處理細(xì)胞,制造體外氧化應(yīng)激的環(huán)境。并予以富氫培養(yǎng)基干預(yù),通過觀察細(xì)胞增殖的情況,抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)(SOD和GSH)表達(dá)、DNA氧化損傷指標(biāo)(8-OHdG),來判斷氫氣對FLS氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。同時(shí),我們檢測了MAPK、NF-KB和TGF-β1,以評價(jià)MAPK通道和TGF-β1對FLS氧化應(yīng)激反應(yīng)有無影響。選用從兒童皮膚中分離的成纖維細(xì)胞,通過雙氧水處理細(xì)胞,制造體外氧化應(yīng)激的環(huán)境。并予以富氫培養(yǎng)基干預(yù),通過觀察細(xì)胞增殖的情況;利用Annexin V/PI檢測早期細(xì)胞凋亡和壞死的結(jié)果;借助雙氫溴乙啶(Dihydroethidium,DHE)和2’7’二氯氫化熒光素乙二脂(2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況;通過Elisa分析氧化產(chǎn)物MDA、抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)(SOD和GSH)表達(dá)、DNA氧化損傷指標(biāo)(8-OHdG)。從而判斷氫氣對成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。同時(shí),我們利用Western blot分析Nrf2、CATA、γ-GCS的蛋白表達(dá)的情況,以評價(jià)Nrf2信號通道對成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)有無影響。
三、研究結(jié)果與結(jié)論在此項(xiàng)研究中,我們得到了以下結(jié)果:1、病理結(jié)果顯示正常對照組小鼠標(biāo)本無滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤、血管翳產(chǎn)生以及骨侵蝕等表現(xiàn);CIA模型組有明顯增生的滑膜組織、炎性細(xì)胞的浸潤、血管翳的產(chǎn)生以及部分骨質(zhì)受到侵蝕;富氫水治療組則表現(xiàn)出少量增殖的滑膜細(xì)胞,中性粒細(xì)胞有少量浸潤和輕微的骨侵蝕表現(xiàn)。病理評分提示富氫水治療組較CIA模型組小鼠在各項(xiàng)指標(biāo)病理評分上明顯降低。2、肉眼觀察發(fā)現(xiàn),CIA組小鼠在30天(疾病早期)的時(shí)候有部分小鼠前足出現(xiàn)紅腫,后發(fā)展到后足。在40天(疾病中期)時(shí)候腫脹出現(xiàn)高峰。而富氫水治療組的小鼠肢體紅腫的程度出現(xiàn)的時(shí)間晚于CIA模型組,其腫脹的程度也明顯小于CIA模型組。CIA模型組小鼠在14天左右(即疾病早期),開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI)升高;在21天,達(dá)到峰值,后逐漸下降。富氫水治療組AI指數(shù)升高的時(shí)間和CIA組一致,但升高的幅度明顯小于CIA模型組小鼠。3、對于MH7A細(xì)胞存活率用MTT法檢測的結(jié)果是:與對照組相比,在加入H2O2后細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng),并隨時(shí)間延長,增殖速度加快。而加入氫氣后細(xì)胞增殖受到了明顯的抑制。4、采用Elisa檢測方法發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕滑膜成纖維細(xì)胞在應(yīng)用雙氧水處理后8-OHDG升高了,抗氧化系統(tǒng)中的SOD和GSH降低了。在加入富氫培養(yǎng)基以后,減少了氧化產(chǎn)物8-OHDG的含量,增加了SOD和GSH含量。同時(shí)發(fā)現(xiàn),氫氣抑制了MAPK、NF-κB和TGF-β1的表達(dá)。5、對于成纖維細(xì)胞,術(shù)后24h結(jié)果提示雙氧水(H2O2)處理造成氧化應(yīng)激模型組,與其他各組相比較,有較高的凋亡發(fā)生率。加入氫氣組自發(fā)凋亡率和H2O2處理組相比有所下降。6、活性氧檢測提示經(jīng)H2O2處理的成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高,經(jīng)氫氣處理后,可以顯著降低細(xì)胞活性氧水平。采用Elisa方法檢測發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在應(yīng)用H2O2處理后8-OHDG和MDA升高了,GSH和SOD降低了。而加入富氫培養(yǎng)基后可以減少氧化產(chǎn)物8-OHDG和MDA含量,增加GSH和SOD含量。7、采用western blot檢查發(fā)現(xiàn),加入H2O2后成纖維細(xì)胞Nrf2和γ-GCS降低,CATA也降低了。而加入氫氣以后Nrf2和γ-GCS恢復(fù)正常,CATA水平也升高了。通過上述研究結(jié)果,我們證實(shí)氫氣通過抑制機(jī)體過度的氧化應(yīng)激反應(yīng),可以有效的抑制RA疾病的發(fā)生。氫氣可以激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),對MAPK、NF-κB和TGF-β1的表達(dá)有抑制作用。同時(shí)也激活了Nrf2信號通道。因此,氫氣調(diào)節(jié)RA的氧化應(yīng)激的作用機(jī)制也是非常復(fù)雜的。
