目的:衰老是一個復(fù)雜的過程,主要表現(xiàn)在生理功能的減退同時會伴隨著許多慢性疾病的發(fā)生。目前存在多個衰老理論來解釋這個復(fù)雜的過程,其中包括自由基/氧化應(yīng)激學(xué)說,該學(xué)說認(rèn)為衰老與活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在細(xì)胞或者組織中過度積累導(dǎo)致的氧化損傷密切相關(guān)。基于這種衰老機(jī)制,抗氧化劑可能在治療衰老相關(guān)疾病方面具有潛在的治療價值。氫分子(Molecular hydrogen,H2)是無色、無味的小分子氣體,許多研究認(rèn)為氫分子在體內(nèi)可以起到清除有害自由基,減少氧化損傷的作用。目前氫分子供體多種多樣,何種氫干預(yù)方式對何種疾病效果更好,也是學(xué)界關(guān)注的一個重要問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),H2可以降低氧化低密度脂蛋白和過氧化脂質(zhì)水平,并改善高膽固醇血癥患者的高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)功能。但H2對衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)和HDL功能的影響及其機(jī)制尚不明確。本研究采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導(dǎo)的自由基損傷導(dǎo)致衰老小鼠模型,通過多種途徑:4%氫氣吸入(4%Hydrogen,4%H2)、飲用富氫水(H2-rich water drinking,HRW)、和腹腔注射飽和氫生理鹽水(H2-rich saline injection,HRS)給予小鼠H2,測定血漿中衰老相關(guān)生物標(biāo)志物和多個組織中的氧化應(yīng)激水平,驗證了不同氫干預(yù)方式對該衰老模型的作用效果。同時選擇對氧化應(yīng)激效果明顯的氫干預(yù)途徑--4%H2,來探究H2對HDL功能損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:研究一:氫分子對D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠模型衰老指標(biāo)的影響6周齡雄性C57小鼠,隨機(jī)分為6組(n=10/組):(i)普食對照(Con)組,(ii)D-gal模型(D-gal)組,(iii)D-gal加4%H2(D-gal+4%H2)吸入干預(yù)組,D-gal干預(yù)小鼠每天吸入4%H2,2小時。(Ⅳ)D-gal加飲用富氫水(D-gal+HRW)干預(yù)組,D-gal干預(yù)小鼠每天自由飲用富氫水。(Ⅴ)D-gal加腹腔注射富氫生理鹽水(D-gal+HRS)組,D-gal干預(yù)小鼠每天給予腹腔注射富氫生理鹽水(700μmol/L)劑量為0.1 m L/10g。(Ⅵ)陽性對照組D-gal加阿托伐他汀鈣灌胃0.1 m L/15 mg/kg(Atorvastatin,Ator)。除對照組外,其余各組均給予D-gal皮下注射200 mg/kg體重。實驗干預(yù)8周。首先,觀察并記錄小鼠生長狀態(tài),內(nèi)眥靜脈取血并用含有EDTA抗凝劑的EP管收集血液,取材,記錄小鼠體重、胸腺、肝臟和脾臟重量。計算體重變化,肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)。臟器指數(shù)計算公式=臟器重量/小鼠體重。其次,應(yīng)用試劑盒檢測了血漿中以游離脂肪酸(Free fatty acids,FFA)為代表的血脂指標(biāo)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)為代表的炎癥指標(biāo)、晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)為代表的糖化指標(biāo)、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,TAOC)為代表的氧化指標(biāo)、:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)為代表的肝功能指標(biāo)和肌酐(Creatinine,CRE)為代表的腎臟指標(biāo)。同時,我們還使用HE染色,觀察了小鼠肝臟組織的形態(tài)變化。最后,使用試劑盒檢測肝臟、腦、心臟組織中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxides,LPO)的含量和過氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性,來驗證氫氣干預(yù)對氧化應(yīng)激的影響。研究二:氫分子對D-gal小鼠HDL結(jié)構(gòu)功能損傷的影響(Con組,D-gal組,D-gal+4%H2應(yīng)用于該實驗)1.HDL分離:將3只小鼠血漿混和成一個待檢測的血漿樣本,每組4個樣本。應(yīng)用快速蛋白質(zhì)液相色譜(Fast protein liquid chromatography,FPLC)根據(jù)層析法分離出血漿中的HDL。2.HDL血脂檢測:應(yīng)用Bradford蛋白濃度測定試劑盒定量測定血漿中HDL的蛋白濃度。3.HDL抗氧化能力及相關(guān)酶檢測:超速離心法分離小鼠血漿中的HDL,用檢測生成MDA的含量來評估低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)的氧化的程度。同時試劑盒檢測血漿中脂蛋白磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2)的活性。4.HDL的脂質(zhì)組學(xué):將分離好的HDL使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法進(jìn)行靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測。5.HDL的蛋白組學(xué):將分離好的HDL,使用Label-free法進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。統(tǒng)計分析實驗結(jié)果采用Graph Pad Prism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。兩組組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗進(jìn)行分析。多組比較采用單因素方差分析。當(dāng)P<0.05時,認(rèn)為具有顯著差異。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0進(jìn)行。結(jié)果一、氫分子對D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠模型衰老指標(biāo)的檢測結(jié)果1.基本指標(biāo)結(jié)果:D-gal組小鼠的體重、肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著下降(P<0.05),脾臟指數(shù)無明顯變化。氫氣干預(yù)后,三種給氫途徑對體重降低沒有顯著改變;HRS可以顯著提升肝臟指數(shù)(P<0.05);4%H2可以顯著提升胸腺指數(shù)(P<0.05);HRW可以顯著提升脾臟指數(shù)(P<0.05)。2.血漿脂質(zhì)檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿FFA水平顯著升高(P<0.001)。不同的給氫途徑干預(yù)后均可以顯著降低FFA水平(HRW組P<0.001,HRS組P<0.001,4%H2組P<0.01)。3.炎癥因子檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿TNF-α水平顯著上升(P<0.05)。不同的給氫途徑干預(yù)后TNF-α水平均顯著下降(HRW、HRS組P<0.001,4%H2組P<0.05)。4.糖化指標(biāo)檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿AGEs水平顯著上升(P<0.01)。不同的給氫途徑干預(yù)后均可以降低AGEs水平(HRW組P<0.001,4%H2組P<0.05,HRS組P>0.05)。5.氧化指標(biāo)檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿TAOC水平降低(P<0.01)。不同的給氫途徑干預(yù)后均可以升高TAOC的水平(HRW、HRS組P<0.001,4%H2組P<0.05)。6.肝損傷標(biāo)志物檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿中ALT活性顯著上升(P<0.01),不同給氫途徑均可顯著降低其活性(P<0.05)。7.腎損傷標(biāo)志物檢測結(jié)果:D-gal組小鼠血漿中CRE水平顯著上升(P<0.05),吸入4%H2可顯著降低其活性(P<0.05)。8.HE染色結(jié)果:HE染色后,Con組肝細(xì)胞正常、排列規(guī)則、肝索完整。相反,D-gal組有大量炎癥細(xì)胞浸潤并且伴有肝細(xì)胞凋亡。不同的給氫途徑治療后均得到緩解,表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤減少,壞死的肝細(xì)胞減少。9.肝臟組織氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果:D-gal組小鼠肝臟組織中LPO、MDA水平顯著上升(P<0.001),SOD活性顯著下降(P<0.001)。三種給氫途徑均可以降低LPO、MDA的水平(P<0.05),提高SOD的活性(P<0.05)。10.腦組織氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果:D-gal組小鼠腦組織中LPO、MDA水平顯著上升(P<0.05),SOD活性顯著降低(P<0.05)。4%H2吸入可以顯著降低LPO、MDA水平(P<0.05),三種給氫途徑均可提高SOD活性(P<0.01)。11.心臟組織氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果:D-gal組小鼠心臟組織中LPO、MDA水平顯著上升(P<0.001),SOD活性有降低趨勢。4%H2吸入可以降低LPO、MDA水平(P<0.05),三種給氫途徑對SOD活性沒有顯著影響。

二、氫分子對D-gal小鼠HDL結(jié)構(gòu)功能損傷的保護(hù)作用的結(jié)果通過以上實驗數(shù)據(jù),對比三種給氫途徑(4%H2,HRW,HRS)的作用效果,發(fā)現(xiàn)4%H2在緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老過程作用效果更為明顯。因此接下來實驗選擇4%H2組的樣本進(jìn)行下一步的研究。1.4%H2干預(yù)的對衰老指標(biāo)的干預(yù)結(jié)果:D-gal組小鼠血漿、肝臟和腎臟中的AGEs、血漿中的IL-6和MDA含量均顯著上升(P<0.05),4%H2干預(yù)后均顯著降低(P<0.05)。2.HDL抗氧化能力檢測結(jié)果:D-gal組HDL的抗LDL氧化能力降低,MDA的形成增加(P<0.01)。4%H2干預(yù)后HDL抗氧化能力顯著提高(P<0.05)。3.HDL相關(guān)酶檢測結(jié)果:D-gal組血漿中Lp-PLA2活性增加(P<0.05),H2干預(yù)可顯著降低Lp-PLA2活性(P<0.05)。4.HDL的脂質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果:HDL樣本中共定量450種脂質(zhì),其中有146種脂質(zhì)表現(xiàn)出顯著的差異。與Con組相比,D-gal組有144種脂質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05且|FC|>1.2),主要為甘油三酯類。與D-gal組相比,D-gal+4%H2組14種脂質(zhì)改變,且均顯著下調(diào)(P<0.05且|FC|>1.2),主要為甘油三酯和膽固醇酯類。5.HDL的蛋白組學(xué)檢測結(jié)果:HDL樣本中共定量479種蛋白。與Con組相比,D-gal組有18種蛋白表達(dá)顯著上調(diào),8種蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05且|FC|>1.2)。與D-gal組相比,D-gal+4%H2組有4種蛋白顯著上調(diào),7種蛋白顯著下調(diào)(P<0.05且|FC|>1.2)。結(jié)論:1.不同給H2途徑可改善D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠的氧化應(yīng)激。2.在不同的給H2途徑中,4%H2吸入對降低部分組織的氧化應(yīng)激標(biāo)志物效果最明顯,而其他途徑在大多數(shù)指標(biāo)上的效果相同。3.4%H2吸入可改變D-gal小鼠血漿HDL的脂質(zhì)組成,主要為甘油三酯。4.4%H2吸入可改變D-gal小鼠血漿HDL的蛋白質(zhì)組成,改善HDL的抗氧化功能。5.4%H2對氧化應(yīng)激引起的衰老的緩解作用可能與改善HDL結(jié)構(gòu)功能相關(guān)。6.H2治療可能是一種很有前途的抗衰老干預(yù)措施。