目的下肢缺血再灌注(Limb ischemia-reperfusion,LI/R)是臨床上常見的病理過程,不僅會損害骨骼肌的局部結(jié)構(gòu)與功能,同時也會引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),損傷其他遠(yuǎn)端器官如心臟、肺、腎、腦,甚至多器官功能障礙衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最終會導(dǎo)致死亡,目前尚無有效的治療方法。值得注意的是,肺是回流靜脈血最先進(jìn)入的器官,靜脈血液中的有害物質(zhì)首先作用于肺,因此肺是最脆弱的器官之一,易引起急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)。近年來,對LI/R-ALI機(jī)制的研究多集中在氧化應(yīng)激方面,大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的生成被認(rèn)為是LI/R-ALI的重要因素之一。最近,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)氫分子具有抗氧化,抗炎、抗凋亡的作用,并對多種器官的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,然而是否能減輕下肢缺血再灌注引起的急性肺損傷,目前尚不清楚。Nrf2/ARE通路是迄今發(fā)現(xiàn)最為重要的抗氧化應(yīng)激通路,但下肢缺血再灌注對肺內(nèi)Nrf2/ARE通路的影響以及氫分子對肺內(nèi)Nrf2/ARE通路的影響尚不清楚。此外,自噬作為一種新的細(xì)胞程序性死亡方式,在缺血再灌注中的作用越來越受到人們的關(guān)注,但其在缺血再灌注損傷中的作用及氫分子對自噬的作用尚存爭議?；谏鲜鰡栴},我們建立了下肢缺血再灌注致急性肺損傷的小鼠模型,來探討氫分子對下肢缺血再灌注急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制,以及Nrf2/ARE通路及自噬在這一病理過程中的作用機(jī)制。研究方法動物:本實驗選用8-12周齡的健康C57BL/6野生型小鼠,雄性,體重大約在20-25g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,并在山東第一醫(yī)科大學(xué)動脈粥樣硬化研究所飼養(yǎng),實驗動物房間12小時的光/暗交替循環(huán),小鼠自由進(jìn)食和飲水。房間溫度保持在22℃±3℃,相對濕度保持在60%±5%,并且所有實驗均經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),并按照IASP(國際疼痛研究協(xié)會)的指導(dǎo)原則使用動物。實驗分為三組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)與氫生理鹽水組(Hydrogen組)。模型及給藥:30只小鼠隨機(jī)分為三組:(1)假手術(shù)組(Sham,n=10);(2)模型組(Model,n=10);(3)氫生理鹽水組(Hydrogen,n=10)。提前制備氫生理鹽水。麻醉小鼠,切開右后肢皮膚,游離出股動脈,在腹股溝韌帶附近使用動脈夾將股動脈夾閉,缺血4h后,去除動脈夾并恢復(fù)右下肢的血流,假手術(shù)組(Sham)只游離不夾閉。假手術(shù)組(Sham)與模型組(Model)再灌注的同時腹腔立即注射5ml/kg的生理鹽水;氫生理鹽水組(Hydrogen),再灌注的同時腹腔立即注射5ml/kg的氫生理鹽水。再灌注15h后取血,脫臼處死三組中的所有小鼠。切開胸腔,暴露心臟,將灌流針插入左心室,小剪刀剪開右心耳,用冷生理鹽水進(jìn)行心臟灌流,隨后取出肺組織,部分保存于-80℃下備用,部分保存于4%多聚甲醛中固定。HE染色:取出在4%多聚甲醛中固定的肺組織,石蠟包埋并切成5μm的薄片,脫蠟水化后經(jīng)伊紅-蘇木素染色,置于正置顯微鏡下觀察。MDA含量與SOD活性的測定:制備肺組織勻漿,分別用TBA法和WST-1法檢測肺組織中的MDA含量與SOD活性,用酶標(biāo)儀讀取各樣本的吸光度值。免疫組織化學(xué)檢測肺組織中的Nrf2,HO-1,NQO1:取出在4%多聚甲醛中固定的肺組織,石蠟包埋并切成5μm的薄片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,置于顯微鏡下觀察并用Image-proplus 6.0分析。蛋白提取及Western blot:分別使用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒,RIPA-蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑混合物抽提肺組織核蛋白,總蛋白和磷酸化總蛋白后,利用Western blot檢測核蛋白Nrf2,胞漿蛋白HO-1,NQO1及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,Atg-5,LC3B,P62,P-m TOR的表達(dá)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測神經(jīng)酰胺:LC-MS/MS法分析肺組織內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量。統(tǒng)計學(xué)分析:統(tǒng)計學(xué)分析采用Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,使用Tukey法對各組進(jìn)行多重比較。
定量實驗數(shù)據(jù)都表示為mean±SEM。當(dāng)P值小于0.05時,認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.氫生理鹽水可以改善下肢缺血再灌注引起的肺損傷假手術(shù)組可觀察到正常的肺組織結(jié)構(gòu),肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整,肺泡壁薄且細(xì)胞排列整齊,連接緊密,無出血與炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。模型組肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂,肺泡壁較厚,細(xì)胞排列不整齊,連接不緊密,肺組織內(nèi)有明顯的出血和炎性細(xì)胞浸潤。氫生理鹽水處理后肺組織損傷的現(xiàn)象都得到明顯改善。2.氫生理鹽水能有效抑制下肢缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激與假手術(shù)組相比,模型組MDA含量顯著增加,SOD活性顯著降低,而氫生理鹽水處理后能明顯改善脂質(zhì)的過氧化,MDA含量明顯減少,SOD活性顯著增強(qiáng)。3.氫生理鹽水可以通過上調(diào)Nrf2信號通路增強(qiáng)抗氧化能力(1)免疫組織化學(xué)檢測顯微鏡下顯示,假手術(shù)組內(nèi)核蛋白Nrf2及下游胞漿蛋白HO-1及NQO1呈現(xiàn)出低表達(dá)的狀態(tài),與假手術(shù)組相比,模型組與氫生理鹽水組肺組織內(nèi)核蛋白Nrf2及下游胞漿蛋白HO-1及NQO1呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài),尤其是在肺泡上皮細(xì)胞,及支氣管表達(dá)最為明顯。采集圖像后,用Image-proplus 6.0圖像軟件分析IOD,模型組肺組織內(nèi)Nrf2,HO-1,NQO1的IOD明顯高于假手術(shù)組,氫生理鹽水組肺組織內(nèi)Nrf2,HO-1,NQO1的IOD明顯高于模型組。(2)Western blot結(jié)果顯示,模型組,氫生理鹽水組與假手術(shù)組相比肺組織內(nèi)核蛋白Nrf2及下游胞漿蛋白HO-1及NQO1表達(dá)均顯著增加,氫生理鹽水組與模型組相比肺組織內(nèi)核蛋白Nrf2及下游胞漿蛋白HO-1及NQO1表達(dá)進(jìn)一步增加。4.氫生理鹽水可以抑制由下肢缺血再灌注引起的肺組織自噬上調(diào)模型組與假手術(shù)組相比,Becin-1,Atg-5和LC3B蛋白表達(dá)明顯增加,然而,經(jīng)過氫生理鹽水處理后,Becin-1,Atg-5和LC3B蛋白表達(dá)明顯減少。P62的表達(dá)水平與Beclin-1,Atg-5和LC3B的表達(dá)水平結(jié)果相符合,模型組與假手術(shù)組相比,P62表現(xiàn)出低表達(dá),而氫生理鹽水處理后,P62蛋白表達(dá)增加。此外還檢測了自噬的上游關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子m TOR,模型組中的m TOR磷酸化水平降低,但氫生理鹽水組中的磷酸化水平顯著增加。5.氫生理鹽水可以減少由下肢缺血再灌注引起的肺組織內(nèi)神經(jīng)酰胺的蓄積Cer d18:1/16:0與Cer d18:1/24:1是神經(jīng)酰胺的重要組成部分,結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組肺組織內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯增多。而與模型組相比,氫生理鹽水組肺組織內(nèi)神經(jīng)酰胺含量明顯減少。結(jié)論1.氫分子可以改善由下肢缺血再灌注引起的肺損傷;2.氫分子可以通過激活Nrf2/ARE抗氧化應(yīng)激通路來減輕肺組織的氧化應(yīng)激損傷;3.氫分子可以抑制由下肢缺血再灌注引起的肺組織自噬上調(diào);4.氫分子可以減少由下肢缺血再灌注引起的肺組織內(nèi)神經(jīng)酰胺的蓄積。