氫化酶是細(xì)菌代謝氫氣的基礎(chǔ)，也說(shuō)明氫氣是生物分子的關(guān)鍵證據(jù)。利用這種酶，細(xì)菌等微生物可以制造和利用氫氣，氫氣可作為這些微生物的能量介質(zhì)。氫能源技術(shù)中的生物制氫也包括試圖能模擬氫化酶的功能，把其他如太陽(yáng)能轉(zhuǎn)變?yōu)闅淠堋?br />  

線粒體是真核細(xì)胞發(fā)電廠，其最重要的電子傳遞單元是線粒體復(fù)合物，非常有意思的是，線粒體復(fù)合物I竟然可能是細(xì)菌氫化酶的后代，這不僅證明氫氣在生命物質(zhì)能量代謝過(guò)程中的核心地位，也提示氫氣在地球生命世界中的潛在廣泛作用。本文重點(diǎn)介紹氫化酶和復(fù)合物I之間的進(jìn)化相關(guān)性。
 

氫化酶是線粒體復(fù)合物I電子傳遞功能單元的祖先分子成分，不過(guò)受地球大氣氧氣水平的影響，氫化酶進(jìn)化為復(fù)合物I從分解氫氣釋放電子演變?yōu)閭鬟f電子的功能，這是今天生物學(xué)的看法。從進(jìn)化角度看，線粒體復(fù)合物I這種源于氫氣代謝酶的后代分子，有可能仍然保留著代謝氫氣的潛力，相反氫氣也可能會(huì)對(duì)這種反應(yīng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，這非常符合生物體系中產(chǎn)物就是調(diào)節(jié)物的普遍現(xiàn)象。因此，線粒體復(fù)合物I可能是氫氣調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的分子靶點(diǎn)，就是我們一種夢(mèng)寐以求尋找的氫氣效應(yīng)的靶點(diǎn)。從這個(gè)角度看，全面了解線粒體復(fù)合物和氫化酶的進(jìn)化歷程，對(duì)理解其功能，特別是尋找氫氣發(fā)揮作用的分子靶點(diǎn)，具有重要意義和價(jià)值。這正是我最近圍繞氫氣代謝、氫化酶和線粒體整理相關(guān)研究資料的根本目的。
 

Volbeda A , Fontecilla-Camps J C . The Evolutionary Relationship Between Complex I and [NiFe]-Hydrogenase[M]// A Structural Perspective on Respiratory Complex I. Springer Netherlands, 2012.
 

摘要：線粒體復(fù)合物I全名為NADH泛醌氧化還原酶，含義是這種蛋白分子復(fù)合物的功能是氧化還原反應(yīng)，是將NADH的電子傳遞給泛醌，使NADH氧化，使泛醌還原的催化酶。
 

復(fù)合物I是有氧生物線粒體內(nèi)呼吸鏈的首個(gè)元件，在結(jié)構(gòu)上和[鎳鐵]氫化酶相關(guān)。一個(gè)比較可信的假說(shuō)認(rèn)為，可溶性氫化酶和膜結(jié)合逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體聯(lián)合進(jìn)化形成復(fù)合物I的祖先分子，逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的功能。研究發(fā)現(xiàn)許多微生物都存在這種氫化酶。本文對(duì)受環(huán)境氧分壓選擇壓力導(dǎo)致氫化酶進(jìn)化為復(fù)合物I的過(guò)程進(jìn)行討論，通過(guò)對(duì)復(fù)合物親水區(qū)晶體結(jié)構(gòu)和鎳鐵氫化酶進(jìn)行比較，推測(cè)氧化還原誘導(dǎo)了質(zhì)子泵4螺旋結(jié)構(gòu)重組。
 

一、氫化酶和復(fù)合物I同源性的發(fā)現(xiàn)
 

Böhm R等1990年代意外發(fā)現(xiàn)，線粒體復(fù)合物I和鎳鐵氫化酶存在同源關(guān)系。鎳鐵氫化酶能把氫氣氧化和質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)偶聯(lián)起來(lái)，這類似線粒體復(fù)合物的功能。鎳鐵氫化酶和復(fù)合物I序列類似性最先報(bào)道的是大腸桿菌甲酸氫解離酶三個(gè)開發(fā)閱讀框，其中一個(gè)和氫化酶大亞單位結(jié)構(gòu)相關(guān)。1991年有研究發(fā)現(xiàn)，牛線粒體復(fù)合物I的75和51kDa亞單位和羅爾斯通菌氫化酶可溶性NAD+氫化酶兩個(gè)硫酸鋅脫氫酶亞單位接近。后來(lái)發(fā)現(xiàn)復(fù)合物I和鎳鐵氫化酶小亞單位N末端黃素氧化還原蛋白顯著類似，多種類似情況見(jiàn)硫酸鋅脫氫酶亞單位和去果胚珠型脫硫弧菌氫化酶等。
 

Böhm R, SauterM, Böck A (1990) Nucleotide sequence and expression of an operon in Escherichiacoli coding for formate hydrogenlyase components. Mol Microbiol 4:231–243
 

圖1復(fù)合物I和氫化酶相關(guān)的圖解。
 

中間下排是15個(gè)Nqo亞單位的完整嗜熱菌復(fù)合物I模型(Efremov et al. 2010 )。從左順時(shí)針旋轉(zhuǎn)分別是：
 

巴克菌能量轉(zhuǎn)換氫化酶(Hedderich 2004 )。
 

集胞藻5同源亞單位組成的NAD(P)+還原鎳鐵氫化酶(Cournacet al. 2004 )。
 

異二聚體鐵鎳(硒)氫化酶(Volbeda et al. 1995 ; Garcin et al. 1999 )。
 

海棲熱袍菌3亞單位NADP+還原鐵鐵氫化酶(Verhagenet al. 1999 )。
 

梭菌二型可溶鐵鐵氫化酶(Peters et al. 1998 )。
 

去磺弧菌可溶鐵鐵氫化酶(Nicolet et al. 1999 ).
 

復(fù)合物I和許多氫化酶序列都存在類似性。例如海棲熱袍菌三亞基鐵鐵氫化酶，集胞藻的5亞基氫化酶，膜結(jié)合多亞基鎳鐵氫化酶。膜結(jié)合氫化酶有6個(gè)保守核心亞基和復(fù)合物I相關(guān)(Hedderich 2004 )。
 

這些氫化酶的典型代表如大腸桿菌氫化酶、一氧化碳誘導(dǎo)紅螺菌氫化酶和甲烷菌能量轉(zhuǎn)換氫化酶等。和復(fù)合物I一樣，這些氫化酶的基本功能是質(zhì)子泵。甲烷菌F 420氫氣脫氫酶復(fù)合物也具有質(zhì)子泵功能，其11和13亞單位和復(fù)合物I亞單位同源(Deppenmeier 2004 )。不同于用NADH為供氫體，甲烷菌供氫體是F420和氫氣，電子受體為1,4-甲橋萘。
 

二、鎳鐵氫化酶和復(fù)合物I同源的追溯
 

復(fù)合物I和鎳鐵氫化酶的關(guān)系源于能量代謝和大氣氧氣含量。最早進(jìn)化步驟是可溶性二聚體鎳鐵氫化酶和膜結(jié)合逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體的聚合，后者主要是K+/H+或Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Mathiesen and Hägerhäll 2003 )。
 

隨后是捕獲更多氧化還原亞單位，逐漸演化為偶聯(lián)質(zhì)子泵的泛醌氧化還原酶。這種復(fù)合物氧化氫氣，還原泛醌，泵出質(zhì)子。這種蛋白是細(xì)菌復(fù)合物I、甲酸脫氫酶、古甲烷菌F420氫氣泛醌還原酶和膜結(jié)合氫化酶的共同祖先。這些氫化酶小亞基和大亞基和復(fù)合物I有高度同源性，這種同源性超過(guò)可溶性鎳鐵氫化酶，這一現(xiàn)象支持這種進(jìn)化模型(Friedrich and Weiss 1997 )。后期招募逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體和其他亞單位，逐漸失去氫化酶活性，獲得/硫辛酰胺脫氫酶活性，變成復(fù)合物I。泛醌結(jié)合位點(diǎn)居于嗜熱鏈球菌復(fù)合物I的nqo4亞單位，和鎳鐵氫化酶代謝氫氣的活性中心拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)接近(圖2)。
 

圖2嗜熱鏈球菌復(fù)合物I的Nqo4和Nqo6亞單位(下)和細(xì)菌鎳鐵氫化酶(上)，兩者非常神似。細(xì)絲網(wǎng)代表氣體通道。
 

大腸桿菌復(fù)合物I小膜結(jié)合亞單位和膜結(jié)合氫化酶鎳鐵氫化酶大亞單位的谷氨酸和門冬氨酸殘基高度同源，這意味著兩者的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性。可溶性鎳鐵氫化酶和膜結(jié)合逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體聚集可能是因?yàn)樵S多反應(yīng)都需要高還原電子。
 

據(jù)推測(cè)原始地球大氣含有非常豐富的氫氣，這解釋了可溶解性氫化酶存在的合理性(Tian et al. 2005 )。但是氫氣非常容易逃逸到太空，地質(zhì)時(shí)間尺度上地球大氣氫氣濃度會(huì)迅速下降。今天地球大氣氫氣含量極微量，導(dǎo)致氫氣被二氧化碳氧化需要額外能量吸收。有證據(jù)表明產(chǎn)甲烷菌二氧化碳氧化氫氣的過(guò)程需要消耗質(zhì)子或鈉離子電化學(xué)梯度能量 (Hedderich 2004 ) 。
 

偶聯(lián)氧化還原反應(yīng)和膜離子梯度熱力學(xué)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致反向電子傳遞，或者電子傳遞和離子梯度之間存在可逆性。能量傳遞氫化酶的功能是離子泵，和復(fù)合物I不同的是，這些酶不用泛醌作為電子受體(Hedderich 2004 ) ?？赡骐娮觽鬟f和二氧化碳還原可能有選擇優(yōu)勢(shì)形成氫化酶逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物。
 

復(fù)合物I和呼吸鏈的進(jìn)化可能和大氣氧氣濃度提高有關(guān)。當(dāng)?shù)厍蛏瞎夂纤{(lán)菌大量繁殖，大氣氧氣水平逐漸升高，需氧呼吸開始出現(xiàn)。地球大氣氧氣增加被稱為大氧化事件，發(fā)生在23億年前。存在于細(xì)菌和古菌體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶是有氧代謝的關(guān)鍵酶，能把氧氣還原為水。如果基因存在水平轉(zhuǎn)移，最后共同祖先(LUCA)在某些情況應(yīng)使用有氧呼吸。因?yàn)長(zhǎng)UCA生活在20億年前，有氧呼吸已經(jīng)在大氧化事件前進(jìn)化出。在光合作用出現(xiàn)前，水被光分解產(chǎn)生少量氧氣，在氧氣濃度比較高的區(qū)域進(jìn)化出需氧呼吸(Kasting 1993 ) 。
 

在惡劣自然條件下，氧會(huì)變成活性更強(qiáng)的單線態(tài)氧、超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥基自由基等。因?yàn)檠鯕?水的正電位比較高，使用氧氣作為電子最終接受體有比較大的進(jìn)化壓力，但也能讓低電位氫氣釋放更多能量。簡(jiǎn)單說(shuō)就是，氧氣氧化能力比較強(qiáng)大，接受電子可產(chǎn)生更多能量，氧氣作為電子接受體在進(jìn)化上有更多優(yōu)勢(shì)，雖然活性氧也會(huì)給生物體帶來(lái)較大應(yīng)激。
 

馬丁和米勒提出真核線粒體進(jìn)化的氫假說(shuō)。氫假說(shuō)認(rèn)為，真核細(xì)胞來(lái)自一種古菌和一種變形菌共生，變形菌給古菌提供氫氣(Martin and Mueller 1998 )，古菌成為真核細(xì)胞主體，變形菌進(jìn)化為細(xì)胞內(nèi)線粒體。這種觀點(diǎn)存在爭(zhēng)議，因?yàn)闆](méi)有遺傳學(xué)證據(jù)證明存在能產(chǎn)生氫氣的變形菌。也有人認(rèn)為真核細(xì)胞來(lái)自代謝氫氣的古菌和一種需氧呼吸變形菌。許多研究證據(jù)表明，變形菌是線粒體的祖先，借助有氧呼吸，變形菌消耗氧氣能減少氧氣的毒性，這讓古菌獲得了高氧條件下的生存優(yōu)勢(shì)。
 

三、氫化酶和線粒體復(fù)合物I的結(jié)構(gòu)關(guān)系
 

嗜熱鏈球菌復(fù)合物I的3.3 Å分辨率晶體結(jié)構(gòu)顯示其Nqo3、Nqo4、Nqo6和Nqo9亞單位三維結(jié)構(gòu)類似于鎳鐵氫化酶和鐵鐵氫化酶(表2 , 圖1)，其氨基酸序列也有同源性。如圖1所示，在FMN和Nqo1黃遞酶中心和Nqo4泛醌還原位點(diǎn)之間的電子傳遞路線上有7個(gè)鐵硫簇?？拷麱MN的Nqo2內(nèi)末端雙鐵硫簇功能是抗氧化劑。Nqo3C末端鐵硫簇位置太偏無(wú)法參與電子傳遞。根據(jù)和鐵鐵氫化酶序列類似，推測(cè)一些復(fù)合物I可能也參與外部氧化還原亞基電子傳遞過(guò)程。
 

2010年解析的復(fù)合物I有7個(gè)疏水膜結(jié)合亞單位，其中Nqo12和Nqo8分別和甲烷八疊球菌能量轉(zhuǎn)換膜結(jié)合氫化酶亞單位A和B同源。Nqo12和Nqo8也和細(xì)菌鈉或鉀逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體同源，這符合質(zhì)子泵的特征。另外Nqo12、Nqo13和 Nqo14也有同源性。
 

復(fù)合物I和NAD+還原鎳鐵氫化酶HoxEFUYH類似。按照氨基酸序列，這種酶應(yīng)包含2個(gè)鐵硫簇，其中1個(gè)在HoxU和第二個(gè)4鐵硫簇相關(guān)，后者在鐵氧化還原蛋白樣亞基Nqo3和Nqo9內(nèi)。鐵氧化還原蛋白樣亞基能把黃遞酶和氫化酶序列連接起來(lái)。在NADP+還原鐵鐵氫化酶中，同樣具有連接黃遞酶和H簇域的作用，也和簡(jiǎn)單可溶性氫化酶類似。復(fù)合物I泛醌結(jié)合亞單位Nqo4和4鐵硫簇亞單位Nqo6分別高度類似于鎳鐵氫化酶大亞基和小亞基N末端。
 

盡管這些酶催化的反應(yīng)有很大差別，但序列和Nqo4和Nqo6大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)同源性非常高。鎳鐵氫化酶有大小亞基之間疏水氣體通道，是活性位點(diǎn)和分子表面聯(lián)系通路。這個(gè)氣體通道在復(fù)合物I變成一個(gè)更寬大通道，面向復(fù)合物I膜表面(圖2)。復(fù)合物I這一區(qū)域可能變成了泛醌結(jié)合位點(diǎn)。Albracht等報(bào)道，牛復(fù)合物I有兩個(gè)不穩(wěn)定FMN，根據(jù)結(jié)構(gòu)和鎳鐵氫化酶類似推測(cè)結(jié)合在Nqo4亞單位。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，這種不穩(wěn)定FMN也存在于羅爾斯頓氏菌可溶性鎳鐵氫化酶。這種不穩(wěn)定FMN的發(fā)現(xiàn)對(duì)理解復(fù)合物I的功能有重要意義。這意味著對(duì)這些分子純化后必須保持雙功能酶活性才符合自然狀態(tài)。Nqo4和Nqo6之間大部分朝向膜表面有利于提高和醌分子和FMN的結(jié)合機(jī)會(huì)。但是人們對(duì)這個(gè)空穴的精確形態(tài)大小還不清楚，因這些蛋白這個(gè)區(qū)域仍沒(méi)有被解析。采用結(jié)構(gòu)疊加方法，發(fā)現(xiàn)FMN不能和黃素意義結(jié)合，因這會(huì)導(dǎo)致其他結(jié)構(gòu)的塌陷。對(duì)Nqo4和Nqo6與鎳鐵氫化酶序列比較發(fā)現(xiàn)存在許多保守氨基酸序列。這些氨基酸分布在整個(gè)肽鏈上，主要分布在催化活性中心和近端鐵硫簇。大多數(shù)13個(gè)甘氨酸位于β折疊和α/310螺旋前后，是維持主鏈構(gòu)象的重要因素。許多保守疏水氨基酸位于疏水內(nèi)區(qū)。4鐵硫簇4個(gè)半胱氨酸配位中3個(gè)在Nqo6亞單位是保守序列，最接近N末端的是醌結(jié)合通道。另外大量親水氨基酸殘基屬于保守序列，大部分都深埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部。比較有吸引人的推測(cè)是，這些氨基酸和質(zhì)子傳遞有關(guān)。復(fù)合物I兩個(gè)電子還原泛醌伴隨兩個(gè)質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。復(fù)合物I和鎳鐵氫化酶可能有類似的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)通路。雖然復(fù)合物I3.1 Å分辨率親水結(jié)構(gòu)沒(méi)有包括水分子，在保守的Asp401和Asp139之間存在一個(gè)親水洞穴。氫化酶沒(méi)有這種洞穴，相關(guān)空間被3個(gè)保守的組氨酸占據(jù)。Asp401相關(guān)天冬氨酸殘基和鎳鐵氫化酶質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)，面對(duì)膜表面Asp139和質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相互作用。在復(fù)合物I和能量轉(zhuǎn)化氫化酶質(zhì)子可通過(guò)和一個(gè)鏈接膜連接的通路進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。為避免質(zhì)子在轉(zhuǎn)運(yùn)路途泄露，這些通路不能被同時(shí)激活。其功能可能通過(guò)氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)，然后啟動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的變化。鎳鐵氫化酶大亞基長(zhǎng)四螺旋束有3個(gè)α螺旋。這些螺旋變成一個(gè)長(zhǎng)結(jié)構(gòu)分隔為兩個(gè)區(qū)域，在Asp528 和Asp129之間產(chǎn)生一個(gè)親水洞穴。這和復(fù)合物I中Asp401 和Asp139之間的結(jié)構(gòu)情況類似，有利于質(zhì)子跨膜運(yùn)輸。

圖3 復(fù)合物I的Nqo4亞單位和鐵鎳氫化酶大亞單位(Df和Db)的結(jié)構(gòu)對(duì)比。
 

有些功能可能需要區(qū)域移動(dòng)實(shí)現(xiàn)。例如鎳鐵氫化酶大單位的不變His219和Arg63通過(guò)水網(wǎng)和小亞基C末端和黃素樣區(qū)近端連接。在復(fù)合物I前者被鐵氧化還原樣亞單位代替。復(fù)合物I內(nèi)的4鐵硫簇氧化還原電位具有pH依賴性，可被組氨酸169調(diào)節(jié)。如果突變蛋氨酸能消除pH依賴性，但對(duì)質(zhì)子泵的效率沒(méi)有影響。因此質(zhì)子泵不依賴于這些鐵硫簇的氧化還原電位，改變復(fù)合物I的氧化還原電位和泛醌的質(zhì)子化狀態(tài)或許可以控制質(zhì)子流動(dòng)。類似機(jī)制可能也操縱氫化酶的鎳鐵離子活性。
 

四、結(jié)論
 

比較強(qiáng)的證據(jù)表明，線粒體復(fù)合物I是從細(xì)菌鎳鐵氫化酶在進(jìn)化來(lái)。能量轉(zhuǎn)化氫化酶是進(jìn)化的第一步，這種結(jié)構(gòu)是可溶性氫化酶和質(zhì)子泵結(jié)合產(chǎn)生。許多證據(jù)表明，有氧呼吸在大氧化事件前進(jìn)化產(chǎn)生。值得注意的是，復(fù)合物I和鎳鐵氫化酶都是真核細(xì)胞進(jìn)化產(chǎn)生的主要參與者。