王躍振, 李庭庭, 曹紅玲, 等. 吸入高濃度氫氣對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的影響[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2019, 35(10): 1011-1015.目的 研究高濃度氫氣對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的影響及其機(jī)制。
 

方法 雄性SD大鼠30只,體重220～240g,隨機(jī)分為三組,每組10只:假手術(shù)組(S組)、腦創(chuàng)傷組(T組)和氫氣改善組(H組)。S組暴露硬腦膜但不進(jìn)行撞擊,T組與H組通過液壓顱腦損傷撞擊建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型,H組于術(shù)后第1天起每天吸入1h高濃度氫氣
(42%H2-21%O2-37%N2),連續(xù)7d。術(shù)后48h采用HE染色法觀察腦組織病理改變，免疫組化法檢測創(chuàng)傷周圍皮質(zhì)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白MPO和HO-1含量,尼氏染色法觀察尼氏小體來判斷神經(jīng)元狀態(tài),術(shù)后7d采用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax以及caspase-3含量。
 

結(jié)果 與T組比較,H組神經(jīng)元損傷減輕(P<0.05),異常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05),促凋亡蛋白bax、caspase-3及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白MPO、HO-1含量明顯降低(P<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2含量明顯升高(P<0.05)。
 

結(jié)論 高濃度氫氣可減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷,其機(jī)制可能與氫氣抗凋亡以及抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。
 

氫點(diǎn)評：雖然是高濃度吸入，每天吸入1小時(shí)，連續(xù)7天。對于氫氣這種擴(kuò)散能力強(qiáng)大的氣體，在停止吸入30分鐘后，身體內(nèi)大多數(shù)氫氣會經(jīng)過呼吸釋放到體外。氫氣在體內(nèi)持續(xù)作用的時(shí)間比較短，從藥物劑量角度看，高峰濃度比較高，但是持續(xù)藥物濃度并不長。如果要更有效發(fā)揮氫氣的作用，應(yīng)該延長給氫氣的時(shí)間或給氫氣的次數(shù)。學(xué)術(shù)角度，可繼續(xù)閱讀后文：
 

創(chuàng)傷性腦損傷是由于外傷、撞擊等因素導(dǎo)致的顱腦外傷。與此同時(shí)，創(chuàng)傷性腦損傷也是所有國家各個(gè)年齡段致死致殘的主要因素，且每年造成巨大的全球經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在我國，腦外傷是導(dǎo)致城鄉(xiāng)居民死亡的主要因素。目前，關(guān)于改善腦外傷預(yù)后的研究正逐漸受到關(guān)注。腦創(chuàng)傷區(qū)周圍氧化應(yīng)激與凋亡反應(yīng)可能與腦外傷預(yù)后較差具有相關(guān)性。氫氣具有抗氧化以及抗凋亡的作用，且這種作用具有劑量相關(guān)性。已有研究報(bào)道低濃度氫氣的神經(jīng)保護(hù)作用，而關(guān)于高濃度氫氣是否能發(fā)揮更好的神經(jīng)保護(hù)作用尚未可知。為此，本研究將探索高濃度氫氣對腦外傷預(yù)后的影響及其作用機(jī)制。
 

研究方法
 

動物與分組:雄性健康成年SPF級SD大鼠30只，體重220～240g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供[許可證號：SCXK(黑)2013?001]，禁食不禁飲。隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(S組)、腦創(chuàng)傷組(T組)和氫氣改善組(H組)，每組10只。
 

模型制備　大鼠液壓顱腦損傷模型(FPI)是模擬腦外傷的經(jīng)典模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg，于頭皮正中注射2%利多卡因浸潤麻醉。固定大鼠頭部于大鼠神經(jīng)立體定向儀，正中切開頭皮，暴露頭骨，于顱骨前囟門后2mm，矢狀縫左側(cè)25mm，用磨鉆磨出直徑為4mm的骨孔，并確保硬腦膜完好無破損。將大鼠液壓顱腦損傷儀與暴露的硬腦膜緊密的連接，以牙膠密封此連接處，成為一個(gè)密閉的腔隙。待牙膠干涸后，將大鼠液壓顱腦損傷儀的擺錘固定于17°，松開擺錘固定裝置，使擺錘自然下落，瞬時(shí)將液體罐內(nèi)的無菌鹽水沖擊式作用于大鼠硬腦膜，對大鼠造成中度腦創(chuàng)傷，此時(shí)電腦中反饋的沖擊壓力在15～20atm。
 

腦組織形態(tài)學(xué)觀察術(shù)后48h每組各取5只大鼠，深麻醉下依次行生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦組織置于4%多聚甲醛中4℃固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切片(3μm)，分別進(jìn)行以下檢測。(1)HE染色，取腦組織切片行脫蠟、染色、分化、復(fù)染、透明，低倍鏡下(×40)取相同皮質(zhì)形狀的切片視為腦組織同一平面，于高倍鏡下(×400)觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。(2)尼氏染色，切片脫蠟后在70%乙醇中6min左右，37℃孵育，取出切片在蒸餾水中洗至無乙醇為止，置入1%甲苯胺藍(lán)染色15min，分色，鏡下控制、脫水、透明、封片，低倍鏡下(×40)取相同皮質(zhì)形狀的切片視為腦組織同一平面，于高倍鏡下(×400)觀察尼氏小體。
 

(3)免疫組化，石蠟切片與兔抗血紅素加氧酶?1(HO?1)(1∶100)抗體、兔抗髓過氧化物酶(MPO)(1∶200)抗體孵育過夜。第2天孵育二抗后，室溫下進(jìn)行DAB反應(yīng)，脫水、透明、封片，低倍鏡下(×40)取相同皮質(zhì)形狀的切片視為腦組織同一平面，于高倍鏡下(×400)觀察染色情況。
 

Westernblot檢測　術(shù)后7d每組取剩余5只大鼠，取腦損傷周圍區(qū)皮質(zhì)裂解，4℃下14000r/min離心20min，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品用10%的SDS?PAGE膠進(jìn)行電泳分離、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，分別以兔抗β?actin(1∶3000稀釋液)、兔抗bcl?2(1∶1000稀釋液)、兔抗bax(1∶2500稀釋液)和兔抗caspase?3(1∶10000稀釋液)的一抗4℃孵育過夜，次日復(fù)溫后用TBS?T洗膜3次，用相應(yīng)二抗室溫孵育1h，TBS?T洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光劑后暗室曝光，得到條帶。以β?actin為內(nèi)參，用凝膠成像分析系統(tǒng)采集分析bcl?2、bax、caspase?3條帶的積分光密度值，其與相應(yīng)β?actin條帶的積分光密度值之比作為蛋白相對含量。
 

改良神經(jīng)功能評分　術(shù)后第1～7天，每天評估大鼠mNSS，內(nèi)容包括提尾試驗(yàn)、置地活動試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)、反射及反常運(yùn)動試驗(yàn)。記錄各組大鼠四項(xiàng)評分總和，反映其神經(jīng)功能損傷情況。
 

統(tǒng)計(jì)分析　采用SPSS21