斑馬魚骨骼與人類骨骼相似，有礦化基質成分，也有功能性成骨細胞和破骨細胞。由于它們的快速發(fā)育和透明度，斑馬魚胚胎是研究器官發(fā)生，特別是骨發(fā)生的一個強有力模型，它們的骨骼結構發(fā)育迅速，受精后5天即可呈現(xiàn)出第一個椎骨礦化。
 

氫氣已受到廣泛研究，證明作為抗氧化劑具有重要的生物學和改善作用。大多數(shù)研究關注氫氣的抗炎癥抗氧化效應，防治多種相關疾病。Sun等發(fā)現(xiàn)，氫氣對微重力誘導骨丟失具有保護作用，富氫水能減輕微重力模型大鼠骨密度的降低，培養(yǎng)基中加入氫氣可以抑制微重力誘導MC3T3-E1細胞活性氧產生。有研究發(fā)現(xiàn)，氫氣(0.06 ppm)可以改善成年斑馬魚單胞菌屬感染，提高抗菌能力，調節(jié)脾臟、肝臟和腎臟抗炎基因表達。
 

本研究以骨骼發(fā)育為重點，評估氫水對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。實驗中氫水用氫氣發(fā)生器制備氫氣濃度為1ppm，該濃度根據(jù)比例被用于不同的處理組(0%-100%)。5天胚胎于不同氫氣濃度氫水中孵育，使用阿利新藍8GX和紫素紅S染色來染色軟骨和骨骼。在光立體顯微鏡下進行檢查胚胎，計算礦化椎體的數(shù)量來評估礦化率，為每一個胚胎記錄標準化長度。
 

采用不同濃度氫水(0% ~ 100%)，每天處理斑馬魚受精卵5天，測試氫分子對胚胎活力的影響。在胚胎第5天時發(fā)現(xiàn)，胚胎活力從25% 氫水開始受到干擾，結果在100%氫水時胚胎死亡率達到70%(圖1a)。低于15%的氫水對胚胎是安全的，不會影響活力或生長速度。半數(shù)致死劑量LD50以50%氫水計算。
 

不同濃度氫水(0% - 100%)處理受精卵5天，觀察氫對胚胎成骨的影響。第5天利用與每個胚胎長度相關的礦化椎體數(shù)量對重要胚胎的礦化率進行了量化。結果發(fā)現(xiàn)，7%氫水的胚胎礦化水平高出299%(圖1b)。圖1cc顯示胚胎用阿利新藍/茜素紅雙染色，在軸向骨骼中發(fā)現(xiàn)紫色礦化椎骨。對照組胚胎平均有3塊礦化椎骨，而7% 氫水處理的胚胎平均有7塊。軟骨發(fā)育對照組和處理魚之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。
 

Carnovali M, Mariotti M, Banfi G.Molecular hydrogen enhances osteogenesis in Danio rerio embryos.J Fish Biol. 2021 Jan 6
 

氫氣被認為對人體沒有副作用，氫氣可以通過吸入飲用等方法用于疾病改善。本研究中發(fā)現(xiàn)氫水對斑馬魚的毒性閾值大概在15-25%之間。氫水對魚的危害需要考慮氫水中氧氣含量下降的問題，另外魚在氫水中生活，這不同于人飲水，相對劑量遠遠高于人體，25%氫水大概相當于25%氫氣吸入完全飽和的劑量，這一劑量能產生毒性效應仍然需要我們關注。因為文獻中沒有發(fā)現(xiàn)氫氣的毒性，本文作者猜測可能是氫氣影響了氧氣通過皮膚的擴散。
 

斑馬魚胚胎代表一種簡單和快速的模型，因為完全透明，非常方便于探索氫水對骨骼發(fā)育的作用。研究發(fā)現(xiàn)，7%氫水能顯著刺激斑馬魚胚胎椎骨礦化。這種效應可能和氫氣抗氧化作用有關，這種作用能促進成骨細胞成骨效應。離體實驗中，氫氣能中和強毒性自由基保護PC12細胞氧化應激損傷。動物模型中也發(fā)現(xiàn)氫氣對各種氧化應激損傷具有保護作用。成骨細胞受到氧化應激干擾會影響骨骼發(fā)育。這種效應可以通過ERKs和NF-kB信號通路實現(xiàn)。氧化應激也會影響細胞分裂，是骨骼形成的關鍵。研究表明，抗氧化劑能影響人類成骨細胞促進細胞分化，可促進骨骼分化和形成。本實驗發(fā)現(xiàn)，氫氣作為一種抗氧化劑對斑馬魚胚胎成骨細胞產生作用，促進椎骨成骨。7%氫水的作用和成年魚抗感染效應的劑量類似。