蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的物質(zhì)基礎(chǔ),機(jī)體組織和細(xì)胞中所有重要的組成部分都有蛋白質(zhì)的存在。蛋白質(zhì)在體內(nèi)水解成氨基酸被吸收利用,氨基酸經(jīng)過脫氨基作用產(chǎn)生氨。此外,腸道微生物代謝也可以造成氨的釋放,后者對于機(jī)體健康具有毒性。正常生理狀態(tài)下,氨的生成與分解維持著動態(tài)平衡。肝臟通過鳥氨酸循環(huán)將氨形成尿素后再經(jīng)腎臟排出體外。當(dāng)肝臟出現(xiàn)功能異常時,過量的氨就會聚積在體內(nèi)引發(fā)高血氨,進(jìn)而引起一系列的病態(tài)反應(yīng)。氨中毒學(xué)說被認(rèn)為是臨床上肝性腦病(Hepatic encephalopathy,HE)的主要發(fā)病機(jī)制。肝性腦病是由于肝功能嚴(yán)重障礙或門-體分流引起的以代謝紊亂為基礎(chǔ)、輕重程度不同的神經(jīng)精神異常綜合征。目前的理論認(rèn)為,肝性腦病的發(fā)生與氨在體內(nèi)引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。研究表明,氫氣在多種疾病模型及臨床疾病治療中都表現(xiàn)出了良好的改善效果,氫氣在體內(nèi)選擇性地清除羥自由基和亞硝酸陰離子,是一種新型的外源性抗氧化劑;同時,氫氣還表現(xiàn)出抗炎、抗細(xì)胞凋亡和抗代謝異常等良好的生物學(xué)效應(yīng)。氫氣的主要使用方法包括吸入氫氣、飲用富氫水和注射富氫生理鹽水等。

本研究主要從富氫溶液的制備及氫氣在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)方面展開詳細(xì)研究,期望能夠從抗氧化應(yīng)激角度進(jìn)一步確認(rèn)氫氣的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng),主要研究內(nèi)容如下:一、富氫溶液的制備及影響因素研究目的:檢測銨鹽溶液對氫棒產(chǎn)氫的催化效果,并分析溶液中的含氫量與含氧量、氧化還原電位、pH等之間的相互關(guān)系。

方法:將氫棒分別放置于不同濃度的氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、碳酸氫鈉和亞硫酸鈉等溶液的PET瓶中,置于40℃水浴鍋分別反應(yīng)0、2、4、6、8和10h,反應(yīng)結(jié)束后立即檢測溶液中的含氫量、含氧量、氧化還原電位和pH值。結(jié)果:溶液中含氫量隨反應(yīng)時間和銨鹽溶液濃度的增大呈遞增趨勢,含氧量和氧化還原電位隨著含氫量的增加呈遞減趨勢,且溶液中的含氫量與含氧量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.9818);溶液的pH隨著含氫量的增加呈遞增趨勢。結(jié)論:銨鹽對氫棒與水的反應(yīng)具有良好的催化作用,氯化銨催化作用最強(qiáng),硫酸銨次之,碳酸銨、碳酸氫銨較弱。本研究為氫棒在不同溶液中制氫能力提供了詳實的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為深入研究不同濃度的富氫溶液的功能及作用奠定基礎(chǔ)。二、秀麗線蟲氯化銨損傷模型的建立目的:以秀麗線蟲為模式生物,建立穩(wěn)定的氯化銨損傷模型。方法:在檢測氯化銨半數(shù)致死濃度(LC50)的基礎(chǔ)上,采用不同濃度氯化銨溶液(10mM、100mM、1000mM)對L3期秀麗線蟲處理24h,檢測秀麗線蟲的生理水平、運動行為水平和生化水平指標(biāo)的變化,觀察氯化銨引起的毒性作用并分析其毒性作用機(jī)制。

結(jié)果:與對照組相比,氯化銨處理后的各組線蟲在生理水平上,壽命顯著縮短(p<0.05);體長顯著縮短(p<0.01);產(chǎn)卵總量顯著降低(p<0.01)。在運動行為水平上,氯化銨處理后的各組線蟲局部運動能力顯著下降,表現(xiàn)為線蟲單位時間內(nèi)的頭部擺動次數(shù)、身體彎曲次數(shù)和咽泵震動次數(shù)顯著下降(p<0.05)。在生化水平上,氯化銨處理后的各組線蟲體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量顯著上升(p<0.01),線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)顯著下降(p<0.01),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性顯著下降(p<0.01),丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量顯著上升(p<0.01)。氯化銨對線蟲的損傷呈現(xiàn)濃度依賴的效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論:氯化銨對線蟲生理水平、運動行為水平毒性作用顯著,其毒性作用的產(chǎn)生與生成過多ROS引起氧化應(yīng)激、影響抗氧化酶活性有關(guān),為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定的生物學(xué)模型。三、氫氣對氯化銨損傷秀麗線蟲的效應(yīng)研究目的:利用秀麗線蟲氯化銨損傷模型,探究氫氣的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制。方法:氫氣組線蟲自同步化后,連續(xù)10天每天在氫氣環(huán)境下培養(yǎng)8h,同前采用亞致死濃度氯化銨溶液對L3期秀麗線蟲處理24h,設(shè)置低濃度(10mM)、中濃度(100mM)氯化銨處理組和氫氣環(huán)境培養(yǎng)的低、中濃度氯化銨處理組,同時設(shè)置正常組和氫氣環(huán)境培養(yǎng)正常線蟲,取10日齡線蟲檢測生理水平、運動行為水平和生化及分子水平指標(biāo)的變化,同時檢測10mM氯化銨處理組、氫氣環(huán)境培養(yǎng)的10mM氯化銨處理組、正常組和氫氣環(huán)境培養(yǎng)的正常組線蟲腸道菌群的變化,分析氫氣的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)制。結(jié)果:與氯化銨處理組相比,氫氣環(huán)境培養(yǎng)的氯化銨處理后的線蟲體長顯著增加(p<0.05);產(chǎn)卵總量顯著增加(p<0.05);最大壽命及平均壽命出現(xiàn)延長趨勢(p>0.05)。在運動行為水平上,與氯化銨處理組相比,氫氣環(huán)境培養(yǎng)的氯化銨處理后的線蟲單位時間內(nèi)的頭部擺動次數(shù)、身體彎曲次數(shù)和咽泵震動次數(shù)顯著上升(p<0.05)。在生化及分子水平上,與氯化銨處理組相比,氫氣環(huán)境培養(yǎng)的氯化銨處理后的線蟲體內(nèi)ROS含量顯著下降(p<0.05),線粒體膜電位顯著上升(p<0.05),SOD、CAT酶活性顯著上升(p<0.05),MDA含量顯著下降(p<0.05),線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)拷貝數(shù)顯著上升(p<0.05),細(xì)胞凋亡水平顯著下降(p<0.05),線蟲age-1基因、hsp16.2基因、skn-1基因和ape-1基因表達(dá)量顯著下降(p<0.05)。對線蟲腸道微生物的檢測分為4組,分別是正常組、氫氣環(huán)境培養(yǎng)的正常組、10mM氯化銨處理組和氫氣環(huán)境培養(yǎng)的10mM氯化銨處理組,四組之間Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)無顯著性差異(p>0.05);在β多樣性指數(shù)方面,通過LEfSe分析得到四組之間存在具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)識,其中,正常組的特異物種為α-變形菌綱、解糖假蒼白桿菌屬的解糖假蒼白桿菌、根瘤菌目的根瘤菌科,氫氣環(huán)境培養(yǎng)的正常組的特異物種為乳酸菌屬的乳酸菌,10mM氯化銨處理組的特異物種為γ-變形菌綱,氫氣環(huán)境培養(yǎng)的10mM氯化銨處理組的特異物種為假單胞菌目、假單胞菌科、假單胞菌屬的假單胞菌。氫氣環(huán)境培養(yǎng)的正常組和正常組相比,在門水平上,Proteobacteria、Firmicutes豐度無顯著性差異(p>0.05),Bacteroidetes豐度顯著性降低(p=0.001),Actinobacteria豐度顯著性升高(p=0.006);在屬水平上,Pseudochrobactrum、Pseudomonas、Ochrobactrum、Stenotrophomonas豐度顯著性降低(p=0.001),Brevundimonas、Microbacterium豐度顯著性升高(p=0.001)。氫氣環(huán)境培養(yǎng)的10mM氯化銨處理組和10mM氯化銨處理組相比,在門屬水平上,Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes豐度無顯著性差異(p>0.05),Bacteroidetes豐度顯著性降低(p=0.001);在屬水平上,Pseudochrobactrum、Microbacterium豐度顯著性升高(p=0.001);Pseudomonas、Ochrobactrum豐度無顯著性差異(p>0.05),Stenotrophomonas、Brevundimonas豐度顯著性下降(p=0.001)。
結(jié)論:氫氣環(huán)境培養(yǎng)可減少氯化銨對線蟲產(chǎn)生的毒性作用,氫氣的生物學(xué)效應(yīng)與清除ROS、促進(jìn)抗氧化酶的活性、對線粒體損傷的保護(hù)作用和下調(diào)衰老、抗氧化及凋亡等基因表達(dá)水平有關(guān)。

引用：]盧寧.富氫溶液的制備及氫氣對氯化銨損傷秀麗線蟲的效應(yīng)研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué)[2024-06-11].