第一部分納米微泡的制備和表征 研究背景 動(dòng)脈血栓是常見(jiàn)的心血管疾病之一,具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高等特點(diǎn),是缺血性腦卒中、心肌梗塞、下肢動(dòng)脈栓塞、內(nèi)臟動(dòng)脈栓塞等多種心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制,嚴(yán)重危及人類(lèi)生命和健康。動(dòng)脈血栓形成會(huì)導(dǎo)致病變血管的血流量急劇減少,引發(fā)細(xì)胞和組織的嚴(yán)重?fù)p傷,從而導(dǎo)致多器官功能障礙,甚至死亡。快速清除血栓、疏通血管、防止血管再次閉塞是動(dòng)脈血栓改善
的關(guān)鍵要求。目前臨床上有效的改善方法包括手術(shù)干預(yù)和藥物改善。然而,外科手術(shù)存在一系列與設(shè)備作用機(jī)制相關(guān)的并發(fā)癥,具有風(fēng)險(xiǎn)高、成本高和侵入性等弊端?？寡ㄋ幬镉捎诎胨テ诙獭邢蛐圆?、利用率低,需要多次大劑量全身給藥,這不僅增加了額外的醫(yī)療費(fèi)用,也帶來(lái)了出血、過(guò)敏、血壓不穩(wěn)定等副作用。此外,由于抗栓藥物僅作用在血栓表面,難以滲透進(jìn)血栓內(nèi)部,臨床上無(wú)法獲得理想的改善效果。納米技術(shù)可以將藥物制成納米顆粒輸送至靶病變部位進(jìn)行干預(yù),這為抗血栓改善提供了新的思路。因此,深入探索如何將抗血栓藥物靶向遞送至血栓部位或可開(kāi)啟動(dòng)脈血栓改善的新篇章。 研究目的 制備一種可靜脈注射的基于血小板膜(Platelet membrane,PM)的納米微泡(PM@PLGA@P/H2-UK)來(lái)輸送尿激酶(Urokinase,UK)與氫氣(Hydrogen,H2),并對(duì)其表征。
研究方法 首先通過(guò)雙重乳化法合成PLGA@PFH納米微泡,然后在密閉條件下充入H2,制成PLGA@P/H2納米微泡。小鼠取血,離心及反復(fù)凍融后獲取PM。納米微泡表面修飾PM后,將UK綴合在PM上,最終過(guò)濾獲得終產(chǎn)物PM@PLGA@P/H2-UK,同時(shí)也制備了 PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 和 PM@PLGA@PFH-UK 納米微泡。采用同樣的制備方法制備帶有熒光標(biāo)記的納米微泡。 通過(guò) 冰凍透射電子顯微鏡(Cryoprecipitate transmission electron microscope,Cryo-TEM)、掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察PM@PLGA@P/H2-UK的形態(tài)結(jié)構(gòu)。利用馬爾文粒徑儀檢測(cè)PM、UK、PLGA@PFH、PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 和 PM@PLGA@P/H2-UK 的粒徑、多分散指數(shù)(Polydispersity Index,PDI)及Zeta電位。使用熒光光譜儀測(cè)定DiO標(biāo)記PLGA@PFH、PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 及 PM@PLGA@P/H2-UK 的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定納米微泡表面膜蛋白的完整性。使用人尿激酶型纖溶酶原激活因子檢測(cè)試劑盒、總巰基含量檢測(cè)試劑盒驗(yàn)證并計(jì)算UK的負(fù)載量。 研究結(jié)果 Cryo-TEM與SEM結(jié)果顯示合成的PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡為均勻的球形“核-殼”結(jié)構(gòu);粒徑均一,平均直徑約為100 nm;Zeta電位約為-5.26 mV;PDI為0.555。熒光標(biāo)記的納米微泡的最大激發(fā)波長(zhǎng)為460nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為398nm。Western Blot驗(yàn)證了 PM@PLGA@P/H2-UK表面血小板膜蛋白的完整性,表明PM以涂層的方式成功修飾在PLGA@P/H2表面。PM@PLGA@P/H2-UK表面-SH和UK含量的變化證明了 UK與PM的成功結(jié)合。 研究結(jié)論 成功制備了具有PM涂層且負(fù)載有UK和H2的納米微泡(PM@PLGA@P/H2-UK),并完成了相應(yīng)表征。其粒徑均一,形態(tài)規(guī)則,載藥量符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。 第二部分 納米微泡的的體外實(shí)驗(yàn)研究 研究背景 在血栓形成過(guò)程中,血管受損或凝血因子活化可導(dǎo)致血小板、纖維蛋白異常聚集,形成血栓。動(dòng)脈血栓形成往往發(fā)生在高剪切應(yīng)力的血管中,會(huì)阻塞血流或脫落至健康器官的血管中,導(dǎo)致致命的心血管疾病。動(dòng)脈血栓主要由活化的血小板和纖維蛋白構(gòu)成,其中,血小板起著重要的作用,這種血栓通常被稱(chēng)為“白色”血栓。在動(dòng)脈血栓中,纖維蛋白主要以纖維束的形式存在。在血栓收縮過(guò)程中,血小板拉住纖維蛋白,壓縮紅細(xì)胞,導(dǎo)致紅細(xì)胞從雙凹細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗝骟w細(xì)胞。隨著時(shí)間推移,機(jī)化的動(dòng)脈血栓更致密,含有更多的纖維蛋白,血栓的孔隙更少,這導(dǎo)致病理性血栓的滲透性極低,可能會(huì)限制改善藥物的進(jìn)入,削弱了血栓對(duì)抗血小板改善和溶栓改善的反應(yīng)性。有文獻(xiàn)報(bào)道,由受損內(nèi)皮細(xì)胞和活化血小板產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在血栓部位上調(diào),并進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血小板活化,從而促進(jìn)血栓增殖及血管閉塞。是以,清除過(guò)量的ROS將會(huì)是另一種新型的血栓改善策略。H2是一種安全有效的抗氧化劑,其在血栓改善中的研究相對(duì)較少,具有良好的發(fā)展前景。因此,開(kāi)發(fā)新型藥物遞送系統(tǒng)將抗栓藥物靶向遞送至血栓部位并清除過(guò)量的ROS可以更安全、更有效地改善患者的溶栓效果。 研究目的 通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡具有超聲響應(yīng)性、抗氧化作用、體外溶栓等效果。 研究方法 1.通過(guò)倒置顯微鏡觀察PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡的超聲響應(yīng)性,并計(jì)算其H2釋放量。 2.利用CCK-8檢測(cè)不同濃度的PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)和 Raw264.7 細(xì)胞孵育 12 h 后的細(xì)胞存活率。通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)考察納米微泡的體外生物安全性。 3.使用過(guò)氧化氫(H2O2)含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定納米微泡的體外抗氧化能力。 4.取小鼠全血和凝血酶孵育形成血栓后與不同納米材料共孵育,評(píng)價(jià)PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡的體外溶栓效果。 研究結(jié)果 1.通過(guò)相變實(shí)驗(yàn)測(cè)試了納米微泡的超聲響應(yīng)性,納米微泡的直徑隨著超聲波強(qiáng)度的增加而增大。PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡經(jīng)超聲爆破后,H2濃度最高可達(dá)1.1 ppm;而未經(jīng)超聲爆破的納米微泡,最高H2釋放量?jī)H達(dá)0.5 ppm,證明了超聲利用空化效應(yīng)爆破納米微泡,釋放H2的可行性。 2.CCK-8及溶血實(shí)驗(yàn)證明,PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡具有良好的生物相容性。 3.PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡能夠以濃度依賴(lài)性的方式有效清除H2O2。 4.體外溶栓的結(jié)果顯示,當(dāng)使用PLGA@P/H2+US、PM@PLGA@P/H2+US和PM@PLGA@P/H2-UK+US處理血凝塊時(shí),上清液中的纖維蛋白和血紅蛋白吸光度(Optical Density,OD)明顯增加,而僅使用US或僅使用UK處理的血凝塊OD值未見(jiàn)明顯增加。PM@PLGA@P/H2-UK+US組的溶栓效果最強(qiáng)。 研究結(jié)論 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡具備良好的超聲響應(yīng)性,證實(shí)了其釋放H2的可行性。該納米微泡能夠有效的清除H2O2,具有良好的體外溶栓效果與生物相容性。 第三部分納米微泡的的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 研究背景 心血管疾病是全球死亡的主要病因,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,且近年來(lái)患者逐漸年輕化,對(duì)社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。血栓形成或血凝塊的過(guò)度形成是造成心血管疾病的主要原因。這些血栓可導(dǎo)致血栓生成部位血流受阻(急性血栓形成)或易位至遠(yuǎn)端部位成為造成血流停止的栓子(血栓栓塞)。動(dòng)脈血栓形成可能導(dǎo)致急性缺血性腦卒中、心肌梗死、下肢動(dòng)脈閉塞、內(nèi)臟動(dòng)脈栓塞。一些血栓性疾病直到晚期才會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀,然而動(dòng)脈血栓的早期診斷對(duì)其轉(zhuǎn)歸、療效和預(yù)防至關(guān)重要。目前動(dòng)脈血栓的診斷主要是依靠臨床表現(xiàn)與影像資料,而動(dòng)脈血栓的診斷、監(jiān)控與防治,耗費(fèi)了大量的資金和資源。臨床干預(yù)旨在快速重建閉塞血管的血流,以最大程度地減少組織損傷。當(dāng)前的抗栓改善分為藥物改善與手術(shù)改善,抗栓藥物包括抗血小板藥物、抗凝劑和溶栓藥?？寡“逅幬锖涂鼓齽┚哂幸种苹蜓泳徰ㄉ傻淖饔?但對(duì)己形成的血栓無(wú)效。只有溶栓藥才能主動(dòng)或被動(dòng)溶解血栓。手術(shù)改善包括機(jī)械取栓和導(dǎo)管溶栓。然而,目前動(dòng)脈血栓的改善存在一些局限性,例如侵入性、輻射、潛在的致命性出血等副作用。因此,為了改善患者的預(yù)后,優(yōu)化當(dāng)前的溶栓技術(shù)具有重要意義。 研究目的 通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),證明PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡具有靶向性、ROS清除能力、體內(nèi)溶栓能力及生物相容性。 研究方法 1.建立小鼠右側(cè)頸動(dòng)脈血栓模型。 2.通過(guò)鼠尾靜脈分別注射DiO標(biāo)記的PLGA@P/H2和PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡進(jìn)入小鼠體內(nèi),循環(huán)1h后,取右側(cè)頸動(dòng)脈制作病理切片,進(jìn)行纖維蛋白免疫熒光染色,然后使用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察納米微泡對(duì)體內(nèi)血栓的靶向性。 3.將小鼠右頸動(dòng)脈血栓模型隨機(jī)分為4組(n=3):血栓形成組、PLGA@P/H2+US組、PM@PLGA@P/H2+US 組、PM@PLGA@P/H2-UK+US 組。改善后,取右側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行H&E染色,在光學(xué)顯微鏡下評(píng)估各組納米微泡的體內(nèi)溶栓效果。 4.取右側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行二氫乙錠(Dihydroethidium,DHE)染色,評(píng)估血栓組織的ROS水平,判斷納米微泡的體內(nèi)抗氧化能力。 5.將PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi),在1天后進(jìn)行血常規(guī)、血生化及重要臟器H&E染色以評(píng)估體內(nèi)安全性。 研究結(jié)果 1.成功構(gòu)建小鼠右頸動(dòng)脈血栓模型。 2.在小鼠頸動(dòng)脈血栓模型中,被PM包覆的納米微泡顯示出更強(qiáng)的熒光,因此具有更好的靶向性。 3.注射不同藥物后,PM@PLGA@P/H2-UK組顯著降低血管中血栓占比,體內(nèi)溶栓效果最好。 4.通過(guò)FeCl3誘導(dǎo)產(chǎn)生的右側(cè)頸動(dòng)脈血栓及血管內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)出較強(qiáng)的DHE熒光,表明血栓部位產(chǎn)生大量的ROS。經(jīng)過(guò)PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡改善后,血栓部位的ROS水平大量降低,提示PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡具有較好的抗氧化活性。 5.血常規(guī)、血生化及重要臟器H&E染色均證實(shí)該P(yáng)M@PLGA@P/H2-UK納米微泡具備良好的生物相容性。

研究結(jié)論 在動(dòng)物水平成功建立頸動(dòng)脈血栓模型,PM@PLGA@P/H2-UK納米微泡富集在血栓部位,顯著溶解頸動(dòng)脈血栓,大大降低血栓部位的ROS生成,同時(shí)具有良好的生物相容性。