前四篇“氫氣生物學(xué)機(jī)理”介紹了氫氣與生物界的密切聯(lián)系。作為遠(yuǎn)古地球大氣中的主要成分，氫元素是生命體最基本的元素，與碳元素共同構(gòu)成了碳基生命(C-H)的構(gòu)架，與氧(O-H)、氮(N-H)、硫(S-H)等元素除了形成共價(jià)鍵，還可以形成氫鍵等弱相互作用，這是生物大分子形成高級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)揮功能的重要推動(dòng)力?；跉浠腹δ艿哪芰看x網(wǎng)絡(luò)，使得氫氣擔(dān)負(fù)了推動(dòng)原初真核生物誕生的關(guān)鍵因素。現(xiàn)代的高等生物依然保留有遠(yuǎn)古時(shí)代氫氣代謝的能力，如腸道微生物群落在腸道內(nèi)組成了龐大的產(chǎn)氫和用氫的氫交換市場(chǎng)，在膳食和宿主之間起到了重要的橋梁作用，與其寄居的生物體共同構(gòu)成了超級(jí)生物體;包括真核生物的線粒體電子傳遞鏈在內(nèi)的多種復(fù)合物Ⅰ與氫化酶高度同源。
 

那么，構(gòu)成真核生物細(xì)胞的生物大分子與氫氣是否會(huì)直接發(fā)生作用呢?我認(rèn)為這種可能性是存在的，后邊的幾篇將重點(diǎn)介紹我們?cè)谶@方面的初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)，乙酰膽堿酯酶是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可以與氫氣作用的生物大分子。
 

關(guān)于氫氣和乙酰膽堿酯酶的研究非常偶然。2012年孫學(xué)軍教授到北京工業(yè)大學(xué)講氫氣生物學(xué)，這之前我雖然對(duì)這個(gè)領(lǐng)域有一點(diǎn)接觸但半信半疑，孫教授的講授引發(fā)了我的興趣，我開始思考從哪個(gè)角度入手研究氫氣。當(dāng)時(shí)的考慮是這個(gè)研究應(yīng)該和健康密切相關(guān)。我剛好在申報(bào)關(guān)于農(nóng)藥耐藥問題的項(xiàng)目，對(duì)農(nóng)藥的健康危害的防護(hù)很關(guān)注，就決定由博士生趙嶺試一試，研究氫氣對(duì)目前使用最為廣泛的一類化學(xué)合成殺蟲劑有機(jī)磷農(nóng)藥造成的腦損傷是否會(huì)有幫助。
 

氫氣對(duì)農(nóng)藥造成的腦損傷的保護(hù)作用有機(jī)磷農(nóng)藥分為劇毒類(甲拌磷，對(duì)硫磷等)、高毒類(甲基對(duì)硫磷，氧化樂果、敵敵畏等)、中毒類(敵百蟲、樂果、毒死蜱等)和低毒類(馬拉硫磷、氯硫磷)。劇毒類和高毒類已經(jīng)被禁用，我們選擇常用的中毒類的毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)開展研究。研究選用大鼠作為對(duì)象，每日喂食CPF八周，有一組同時(shí)每天飲用氫水，研究結(jié)果顯示，氫水組CAT、MDA、SOD和GSH等抗氧化指標(biāo)都有改善，這些結(jié)果基本符合預(yù)期，與已經(jīng)報(bào)道的氫氣抗氧化功能一致。但腦組織神經(jīng)元染色的結(jié)果還是讓我們很吃驚，染毒大鼠腦的海馬區(qū)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，氫水染毒組神經(jīng)元明顯改善，表明氫氣在對(duì)抗有機(jī)毒性物質(zhì)損傷方面有積極的作用。據(jù)此我們提出來氫氣對(duì)同樣是有機(jī)毒物的霧霾、毒品、煙等的毒性氫氣也許也可以有對(duì)抗作用，因?yàn)檫@個(gè)研究有另外兩個(gè)結(jié)果引起了我的興趣，抗毒方面的研究我們沒有繼續(xù)擴(kuò)展，但我們欣喜的看到后來有多個(gè)研究進(jìn)一步證明氫氣的抗毒作用。
 

尼氏染色檢測(cè)CPF對(duì)大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷及氫的保護(hù)作用Wang T，et al., 2014
 

2007年，日本太田成男教授提出氫氣與羥自由基和過氧亞硝酸根等毒性自由基直接反應(yīng)的選擇性抗氧化理論(Ohsawa，2007)，這個(gè)階段的研究多集中在CAT、MDA、SOD和GSH等抗氧化指標(biāo)的測(cè)定，并證明氫氣確實(shí)具有抗氧化作用。我們關(guān)于氫氣保護(hù)農(nóng)藥造成的腦損傷的研究在抗氧化方面與已有的報(bào)道基本一致，但有兩個(gè)結(jié)果引起了我的重視：一個(gè)是氫氣對(duì)線粒體的保護(hù)作用，另一個(gè)是對(duì)AChE酶活性的影響。因?yàn)檫@兩個(gè)方向沒有研究報(bào)道，我們決定向這兩個(gè)方向探索。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是有機(jī)磷農(nóng)藥CPF的直接靶點(diǎn)是，判斷動(dòng)物模型是否成功需要測(cè)定血清和腦的AChE的酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPF引起大鼠血清和組織中AChE酶活性的下降，氫氣組的酶活則比染毒組高。正常對(duì)照組血清中AChE酶活為(1.07±0.049)U/ml，CPF暴露組大鼠血清中酶活性降低至(0.69±0.072)U/ml(P<0.05);染毒期間飲用富氫水的大鼠血清中AChE酶活為(0.94±0.073)U/ml，與CPF組相比酶活性上升了36.23%(P<0.05)。與血清中AChE酶活性變化一致，腦組織中AChE酶活性由于CPF染毒而下降，與正常對(duì)照組比降低了62.15%,染毒期間飲用富氫水的大鼠AChE酶活比農(nóng)藥組高近一倍(Wang T，et al., 2014)。造成血清和腦中AChE酶活高的原因主要有兩種可能性，一是基因表達(dá)量高從而產(chǎn)生的酶多了;二是有活性的酶多了。檢測(cè)腦中乙酰膽堿酯酶的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，氫氣組的基因表達(dá)量并沒有比農(nóng)藥組高，甚至還略低;剩下的就是第二種可能性，即可能是氫氣組有活性的酶的量要多一些，這提示氫的保護(hù)作用可能不只限于抗氧化，因此我們決定進(jìn)一步研究AChE純酶。氫氣與乙酰膽堿酯酶酶活性AChE是神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，主要存在于神經(jīng)細(xì)胞和肌肉細(xì)胞之間的突觸間。它在突觸間耐心地等待，并在神經(jīng)信號(hào)傳遞后很快開始行動(dòng)，將乙酰膽堿分解為膽堿和醋酸，有效地阻止了信號(hào)的持續(xù)傳遞，終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，這是膽堿能神經(jīng)元激活后恢復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)所必需的反應(yīng)，否則就可能造成受體細(xì)胞膜持續(xù)去極化而造成傳導(dǎo)阻滯。新生成的膽堿可以被循環(huán)利用，并重新構(gòu)建成新的神經(jīng)遞質(zhì)，用于下一條信息的傳遞。AChE是所有酶中反應(yīng)速度最快的酶之一，可以在80微秒內(nèi)分解一個(gè)分子。越來越多的證據(jù)表明，AchE在神經(jīng)再生、神經(jīng)退行性疾病等方面也發(fā)揮重要作用(Soreq H, et al., 2001)。
 

乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)突觸間的作用
 

我們?cè)谠嚬苤袦y(cè)定了加入氫氣后AChE純酶的活性?？此坪?jiǎn)單的酶活測(cè)定花了幾個(gè)月的時(shí)間，主要原因是AChE具有極高的水解活性，一分子的乙酰膽堿酯酶每秒鐘可以水解25000分子的乙酰膽堿，酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定不容易把握，氣體的加入更增加了測(cè)定的難度。為了排除可能的干擾因素，商品化的試劑盒不能滿足實(shí)驗(yàn)要求只能自己配置試劑，包括酶的稀釋、氫水的加入時(shí)機(jī)、試劑的加入順序等都做了細(xì)致的優(yōu)化。考慮到對(duì)照組和氫水組如果分別兩次測(cè)量操作誤差可能掩蓋真實(shí)的結(jié)果，氫水罐(活力氫源)一旦打開氣體一直在揮發(fā)很難保證兩次的氫氣濃度一致，兩瓶氫水的氫氣濃度就更難一致了。所以我們是用96孔板測(cè)試，用排槍加樣，對(duì)照組和氫氣組同步開始，加樣的同時(shí)計(jì)時(shí)，每個(gè)孔從加樣啟動(dòng)反應(yīng)到出來第一個(gè)數(shù)據(jù)都手工記錄時(shí)間，并盡可能減少這個(gè)時(shí)間?？赡苡腥艘獑枮槭裁床挥米詣?dòng)加樣系統(tǒng)，我們的設(shè)備有自動(dòng)加樣系統(tǒng)，但是嘗試幾次發(fā)現(xiàn)無法滿足要求，做過氣體生物學(xué)研究的應(yīng)該體會(huì)比較深。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是我看著兩個(gè)研究生(劉夢(mèng)昱和王婷婷，她們自稱絕配)做的，我的任務(wù)是給她們打下手，負(fù)責(zé)在旁邊計(jì)時(shí)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果印證了我們的推測(cè)，氫氣確實(shí)可以提高酶活性，改變酶反應(yīng)的各項(xiàng)參數(shù)，當(dāng)加熱把氫水中的氫氣排出后酶活性就沒有變化了(Wang T，et al., 2014)。

調(diào)節(jié)乙酰膽堿酯酶活性：氫分子的一種新功能Wang T，et al., 2014
 

毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)進(jìn)入生物體內(nèi)是可以被代謝的。在肝臟CPF經(jīng)細(xì)胞色素P450的重要成員CYP2B6催化被轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)氧磷毒死蜱(chlorpyrifos-oxon, CPO)，肝臟中的對(duì)氧磷酶1(paraoxonase 1，PON1)將CPO分解為TCP進(jìn)行解毒，但是腦中缺乏PON1，CPO與AChE的活性中心反應(yīng)使酶失活，所以CPF對(duì)于腦的損傷一直是重要的研究方向。

有機(jī)磷農(nóng)藥CPF在生物體內(nèi)的代謝
 

CPO是直接作用于AChE酶的活性中心的抑制劑，在CPO存在下氫氣是否會(huì)對(duì)酶活性有保護(hù)呢?我們?cè)O(shè)計(jì)了CPO抑制劑實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有CPO存在時(shí)，氫氣組的酶活性高于對(duì)照組(見圖，Wang T，et al., 2014)。這提示氫氣處理減弱了CPO對(duì)AChE的抑制作用，這種作用有可能發(fā)生在酶的活性中心。氫氣與AChE作用的可能機(jī)制AchE酶蛋白有兩個(gè)能與乙酰膽堿結(jié)合的部位：峽谷上面是帶負(fù)電荷的陰離子部位，可以結(jié)合帶正電荷的乙酰膽堿，底部是一個(gè)發(fā)生酯解反應(yīng)的催化活性位點(diǎn)。

乙酰膽堿酯酶模式圖
 

酶的活性中心是一個(gè)相對(duì)封閉的空間，其性質(zhì)與溶液中有所不同，所以稱為酶的微環(huán)境。例如，有些酶的活性中心是一個(gè)疏水的微環(huán)境，其介電常數(shù)較低，有利于電荷之間的作用，也有利于反應(yīng)中間物的生成和穩(wěn)定。AchE的活性中心含有三個(gè)重要的氨基酸，即絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)和谷氨酸(Glu)，雖然在蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈上它們并不在一起(200, 400, 327)，但是經(jīng)蛋白質(zhì)折疊形成高級(jí)結(jié)構(gòu)后，卻湊在一起成為“一條直線”。然后發(fā)生一件非常重要的事，Glu 搶走中間 His的氫，然后His去搶Ser的氫，最后Ser留下一個(gè)光禿禿的氧原子，而此氧原子因失去氫有多余的負(fù)電荷而變得極為活躍，可以看作類自由基狀態(tài)，這就是著名的由 Ser-His-Glu(或Asp)構(gòu)成的“催化鐵三角 (catalytic triad)” 結(jié)構(gòu)?？梢钥闯鰜?，本來活性不高的絲氨酸側(cè)鏈的羥基(C-OH)，在活性中心低介電環(huán)境中，羧酸鹽的親核特性通過組氨酸的咪唑環(huán)轉(zhuǎn)移到絲氨酸的羥基。氨基酸之間的相互作用依賴于氫鍵等弱相互作用，由谷氨酸、組氨酸咪唑環(huán)的電子偏移構(gòu)成咪唑環(huán)的堿性作用點(diǎn)，與由絲氨酸羥基構(gòu)成的酸性作用點(diǎn)通過氫鍵鏈接，增強(qiáng)了絲氨酸羥基的親核活性，使之易于與乙酰膽堿結(jié)合形成乙酰-酶的中間體，發(fā)揮催化功能。

乙酰膽堿酯酶活性中心的“鐵三角”結(jié)構(gòu)

AChE水解乙酰膽堿的過程可分為三個(gè)步驟：①乙酰膽堿分子結(jié)構(gòu)中帶正電荷的季銨陽離子頭，以靜電引力與膽堿酯酶的陰離子部位相結(jié)合;同時(shí)乙酰膽堿分子中的羰基碳與AChE酯解部位的絲氨酸的羥基以共價(jià)鍵形式結(jié)合，形成乙酰膽堿和AChE的復(fù)合物。②乙酰膽堿與酶復(fù)合物裂解成膽堿和AChE。③ AChE迅速水解，釋放出乙酸，酶的活性恢復(fù)。反應(yīng)過程中活性中心的水分子參與酶的再生和乙酸的釋放，這個(gè)過程也涉及氫鍵的重排。

Acetylcholinesterase Cleaving Acetylcholine Movie by Alexandre Katos - USAMRICDhttps://www.youtube.com/watch?v=Euu2JRbQ5LI&feature=emb_logo

2010年Belpassi等在JACS發(fā)表研究認(rèn)為，水和氫氣的相互作用伴隨著電荷轉(zhuǎn)移(Charge Transfer,CT)，CT有很強(qiáng)的立體選擇性、各向異性現(xiàn)象，水在不同的方向上既可以充當(dāng)電子供體也可以充當(dāng)電子受體。氫氣是否可能在氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成與電子重排中發(fā)揮作用，從而提高酶活性?在生物體系氫氣對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)是否有擾動(dòng)，氫氣是否能進(jìn)入生物大分子內(nèi)部發(fā)揮功能?氫氣與AChE的研究中發(fā)現(xiàn)氫氣可以提高酶的活性，初步表明存在這種可能性。具有催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)的絲氨酸水解酶類是一個(gè)大的家族，AChE、絲氨酸蛋白酶等都屬于這類酶。AChE屬于α/β水解酶折疊蛋白超家族，這個(gè)家族是成員最多的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白組之一(Lenfant et al.,2013)。它們共同的結(jié)構(gòu)特征就是具有催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。我們關(guān)于氫氣和AChE的研究，是第一次報(bào)道氫氣和酶分子之間可以直接相互作用，提高酶活性。這為解釋氫的生理意義提供了一種新的機(jī)制，也提示氫分子可能影響更多的生化反應(yīng)。氫氣對(duì)AChE酶活影響的研究后，我們嘗試?yán)昧炕?jì)算研究氫氣在酶的活性中心的反應(yīng)細(xì)節(jié)，遇到了一些困難沒有深入下去，也希望感興趣的朋友將來可以一起探討。乙酰膽堿酯酶從研究的操作層面并不是一個(gè)好的模型，為了更方便地研究酶與氫氣的相互作用，我們選擇辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)作為研究對(duì)象。HRP是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，同類蛋白包括細(xì)胞色素氧化酶(線粒體復(fù)合物Ⅳ)、過氧化物酶、細(xì)胞色素P450超家族、一氧化氮合酶等眾多重要的生物酶，這類酶的活性中心含有鐵卟啉，在含有過氧化氫的溶液中酶的活性中心可以產(chǎn)生氧化性強(qiáng)的高價(jià)鐵自由基中間態(tài)，很容易通過光譜的方法捕捉。

參考文獻(xiàn)

Wang T, Zhao L, Liu M, et al. Oral intake of hydrogen-rich water ameliorated chlorpyrifos-induced neurotoxicity in rats[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2014, 280(1):169-176.

馬雪梅, 張?chǎng)? 謝飛,等. 氫氣生物學(xué)作用的生物酶基礎(chǔ)[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2020(1).

Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nature Medicine, 2007, 13(6):688-694.

Soreq H, Seidman S. Acetylcholinesterase — new roles for an old actor[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2001.

Belpassi L , Reca M L , Tarantelli F , et al. Charge-Transfer Energy in the WaterHydrogen Molecular Aggregate Revealed by Molecular-Beam Scattering Experiments, Charge Displacement Analysis, and ab Initio Calculations[J]. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132(37):13046-13058.