青光眼由于眼內(nèi)壓力增高導致視網(wǎng)膜缺血，能引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞變性。氧化應激在神經(jīng)退行性疾病許多病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。青光眼氧化應激導致蛋白氧化損傷是視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞變性和膠質(zhì)細胞功能異常的重要因素之一。
 

活性氧是細胞代謝過程中存在線粒體電子泄露所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，存在一定生理功能，但如果過度增加超過細胞抗氧化能力，會導致細胞內(nèi)大分子如DNA、蛋白和脂類分子的氧化損傷。氧化損傷是細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)不平衡所造成的后果，超氧陰離子是各種活性氧的源頭，在SOD的催化下能變成過氧化氫。大量研究表明，線粒體功能紊亂會出現(xiàn)氧化損傷，青光眼也存在這種類型的氧化損傷。
 

一氧化氮是一種重要信號分子，也是一種重要活性氧，神經(jīng)細胞產(chǎn)生一氧化氮能激活氨基酸NMDA受體，導致神經(jīng)細胞壞死。許多研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮本身也能和超氧陰離子反應產(chǎn)生亞硝基陰離子，亞硝基陰離子是一種強毒性自由基，能引起組織細胞氧化損傷甚至壞死。為研究一氧化氮的毒性，硝普鈉經(jīng)常作為一氧化氮供體被廣泛使用。在神經(jīng)細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞培養(yǎng)時，硝普鈉來源的一氧化氮能和超氧陰離子反應產(chǎn)生亞硝基陰離子造成體外細胞損傷?？紤]到過去沒有人報道氫氣對這種損傷的效應，本研究擬開展這一研究。
 

2007年，該日本醫(yī)科大學小組曾經(jīng)率先報道氫氣是一種選擇性抗氧化物質(zhì)，能中和羥基自由基和亞硝基陰離子造成的體外神經(jīng)細胞損傷。隨后大量研究證明氫氣能對各類氧化損傷和炎癥損傷具有保護效果，給動物飲用含氫水可對多種疾病具有改善效果。如0.8mM的氫水滴眼對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有改善作用，考慮到氫氣的劑量比較小，難以和細胞內(nèi)羥基自由基發(fā)生直接中和反應，羥基自由基在生物體內(nèi)的生物半衰期只有1納秒，說明許多生物物質(zhì)能與羥基自由基發(fā)生快速反應，小劑量氫很難有效競爭中和。更難以想象的是，有學者發(fā)現(xiàn)0.04 或0.08 mM的氫水都可以產(chǎn)生一定效應。盡管日本學者發(fā)現(xiàn)氫能和肝臟糖原結(jié)合，延緩釋放時間(個人認為這是嚴重錯誤的看法)，但仍然無法解釋這一現(xiàn)象?？傊?，羥基自由基作為氫氣在生物體內(nèi)效應分子，其實并沒有明確，或者氫氣在生物體內(nèi)效應分子還沒有真正找到。
 

動物視網(wǎng)膜是一種比較理想的研究工具，最近視網(wǎng)膜整體培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)建立，結(jié)合使用動物基因工程技術(shù)，能研究許多基因在視網(wǎng)膜上的功能，組織培養(yǎng)技術(shù)能連續(xù)體外培養(yǎng)4天，方便各種藥物學研究的實施。目前視網(wǎng)膜培養(yǎng)已經(jīng)在視網(wǎng)膜發(fā)育學、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病研究中發(fā)揮了重要作用。因此，最新研究利用這種工具作為研究氫氣生物學機制的手段。
 

研究采用硝普鈉誘導的視網(wǎng)膜組織損傷為模型，通過培養(yǎng)基溶解氫氣的方法，采用MitoTMRE檢測試劑盒和TUNEL分別觀察氫氣對硝普鈉誘導導致的視網(wǎng)膜細胞線粒體膜電位丟失和凋亡。采用免疫組織化學檢測，評估視網(wǎng)膜酪氨酸硝化水平和氧化應激損傷水平。視網(wǎng)膜損傷程度判斷分別采用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)、內(nèi)層細胞核計數(shù)和視網(wǎng)膜厚度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氫氣能避免視網(wǎng)膜細胞線粒體膜電位丟失和凋亡，減少氧化和蛋白硝基化損傷，同時能抑制硝普鈉誘導的視網(wǎng)膜組織損傷。研究提示氫對視網(wǎng)膜氧化損傷具有保護作用，可能是通過清除亞硝酸陰離子實現(xiàn)。氫氣對青光眼等視網(wǎng)膜病變具有潛在的應用價值。
 

圖1、大鼠視網(wǎng)膜器官組織培養(yǎng)，氫氣對視網(wǎng)膜的線粒體膜電位的影響。
 

(a)視網(wǎng)膜培養(yǎng)圖。(b)視網(wǎng)膜線粒體膜電位染色病理顯微鏡圖片，從上到下分別是正常的視網(wǎng)膜，用藥物SNAP損傷的視網(wǎng)膜，藥物損傷用氫氣改善的視網(wǎng)膜。(c)膜電位測量數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖，藥物損傷導致陽性面積減少，氫氣改善部分恢復。
 

圖2、氫氣對視網(wǎng)膜細胞保護圖，結(jié)果非常形象，圖中箭頭顯示藥物導致視網(wǎng)膜增多，氫氣改善減少陽性細胞數(shù)量。
 

Yokota T, Kamimura N, Igarashi T, et al. Protective effect of molecular hydrogen against oxidative stress caused by peroxynitrite derived from nitric oxide in rat retina[J]. Clinical & Experimental Ophthalmology, 2015, 43(6):568-577.