分子氫與氧化應(yīng)激損傷———從惰性氣體到醫(yī)療用氣體

氣體分子具有重要的醫(yī)療價值，臨床上吸入氧氣用于改善低氧血癥及危重患者，二氧化碳用于多種皮膚病及肛腸疾病的改善，一氧化氮用于新生兒肺動脈高壓的改善;近年研究顯示，一氧化碳可用于改善肺動脈高壓、自發(fā)性高血壓及器官移植，硫化氫改善肺動脈高壓、高血壓、動脈粥樣硬化及心肌缺血損傷等，氣體分子醫(yī)學(xué)受到了基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的高度關(guān)注。

氫是自然界中含量最多的元素，氫元素占宇宙物質(zhì)組成的75%左右。過去大部分生物學(xué)家一直認(rèn)為氫氣屬于生理性惰性氣體，2007年，自然醫(yī)學(xué)雜志首次報道了氫氣可以選擇性地清除細胞毒性的氧自由基，是具有改善價值的抗氧化劑，此后，學(xué)術(shù)界對分子氫的作用機制和實驗改善進行了大量研究，揭示了氫氣具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

1　氫氣的生物學(xué)特點

氫氣是一種無色、無嗅、無味、具有一定還原性的氣體，在空氣中的含量極少，氫氣分子量小且呈電中性，擴散能力很強，能輕易地穿過細胞質(zhì)膜及各種細胞器膜。

生理狀態(tài)下，動物和人體內(nèi)可以產(chǎn)生氫氣。食物中未被小腸完全吸收的碳氫化合物到達結(jié)腸后，在腸道厭氧菌的作用下發(fā)酵，產(chǎn)生氫氣、二氧化碳及短鏈脂肪酸。反應(yīng)過程是蔗糖+5H2O=醋酸+4二氧化碳+8H2;蔗糖+5H2O=丁酸+二氧化碳+4氫氣。催化此反應(yīng)的氫化酶受pH值的影響，pH值為5.5-5.7時，氫氣的生成率最高。產(chǎn)生的氫氣很大一部分被吸收入血，隨血液到達肺臟后可在呼出氣Olson等用50μm的微電極探針測定了正常小鼠胃黏膜的氫氣濃度為43mmol/L(17-93mmol/L)。Maier等用改良的克拉克型微電極測定了正常小鼠肝中平均氫氣濃度為53mmol/L，小腸中氫氣濃度范圍為118-239mmol/L，脾臟中平均氫氣濃度為43mmol/L。有關(guān)細胞氧化損傷的研究表明，只要培養(yǎng)基內(nèi)氫氣濃度達到25mmol/L，就可顯示出明顯的抗氧化作用，這說明在正常小鼠胃、小腸、肝臟、脾臟等腹腔器官內(nèi)，機體內(nèi)產(chǎn)生的氫已經(jīng)明顯超過抗氧化所需要的水平。腸源性氫氣的生理和病理生理意義目前尚不清楚。

2　氫的選擇性抗氧化作用

自由基是指帶有未成對電子的原子、分子或離子，自由基是人體正常的代謝產(chǎn)物，生理情況下，體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與不斷清除的動態(tài)平衡中，自由基過多、過少均會給機體造成不利影響。人體內(nèi)的自由基95%以上屬于氧自由基，包括O2·-(超氧陰離子自由基)、過氧化氫、·OH(羥基自由基)等，這些物質(zhì)具有比分子氧活潑的化學(xué)反應(yīng)性，統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species，ROS)。線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS的主要來源，在線粒體呼吸過程中，電子傳遞鏈中途漏出少量電子可以直接單價還原氧氣形成O2·-，后者在超氧化物歧化酶的催化下轉(zhuǎn)化為過氧化氫。過氧化氫可以在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下生成水而解毒，剩余的O2·-可以使Fe3+和Cu2+還原為Fe2+和Cu+，后兩者與過氧化氫通過Fenton反應(yīng)生成·OH，而目前機體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)能特異清除·OH的生物酶。在這些ROS中，O2·-和過氧化氫毒性作用很弱，并且在生理濃度下具有重要的功能意義，如調(diào)控許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及凋亡等生物學(xué)行為。生理狀態(tài)下體內(nèi)幾乎不存在·OH，在缺血缺氧或炎癥時，體內(nèi)會大量產(chǎn)生各類ROS，其中·OH是氧化性最強的ROS，可以非選擇性地與核酸、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)反應(yīng)，是導(dǎo)致細胞氧化損傷的主要介質(zhì)。以前氧化損傷改善的研究思路是尋找足夠強的還原性物質(zhì)，然而，還原性過強會干擾O2·-和過氧化氫的正常生理功能，因此，選擇性中和·OH的物質(zhì)抗氧化損傷可能具有更重要的臨床意義。

Ohsawa等通過給予培養(yǎng)細胞線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ抑制劑(抗霉素A)來誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。熒光探針結(jié)果顯示，胞內(nèi)氧氣和過氧化氫水平升高，而胞質(zhì)和胞核內(nèi)的·OH水升亦升高。將氫氣溶于培養(yǎng)基后，胞內(nèi)氧氣和過氧化氫水平并未降低，而胞質(zhì)和胞核內(nèi)的·OH水平明顯下降。同時，研究結(jié)果顯示，在氧化損傷后，線粒體發(fā)生去極化，ATP合成減少，脂質(zhì)過氧化，DNA碎裂，細胞壞死、凋亡。將氫氣溶解于培養(yǎng)基中，能夠呈濃度依賴性地抑制上述損傷的發(fā)生，增強細胞活力，這表明氫氣主要通過選擇性中和線粒體中毒性最強的·OH來發(fā)揮抗氧化作用，而并不影響具有重要生理功能的ROS，且抗氧化能力呈濃度依賴性。該小組還研究了氫氣與大腦缺血再灌注損傷的關(guān)系，給大鼠阻斷大腦中動脈的血供90分鐘，再灌注30分鐘，在整個120分鐘內(nèi)給大鼠持續(xù)吸入1%～4%(體積分?jǐn)?shù))的氫氣，24小時后，與對照組比較，吸入氫氣大鼠的腦梗死面積呈氫氣依賴性的降低，以2%～4%氫氣的效果最佳;同時，研究還發(fā)現(xiàn)氫氣在再灌注期吸入有效，而如果只在缺血期吸入則效果不明顯;1周后，吸入氫氣大鼠的腦梗死面積與對照組的差別更為明顯，神經(jīng)學(xué)評分也明顯降低，說明氫氣不僅抑制缺血再灌注的早期損傷，同時也能抑制其進展性損傷。

3　氫氣與氧化性損傷

3.1　氫氣與缺血再灌注損傷

當(dāng)組織細胞缺血、缺氧時，ROS清除系統(tǒng)功能降低，生成系統(tǒng)活性增強，一旦恢復(fù)組織血液供應(yīng)和氧供，ROS便會大量產(chǎn)生與急劇“堆積”，引起強烈的細胞氧化，形成氧化應(yīng)激。Hayashida等的研究發(fā)現(xiàn)，氫氣在心肌缺血再灌注損傷中具有顯著的保護作用。離體灌流大鼠心臟實驗發(fā)現(xiàn)，動物預(yù)先吸入氫氣有利于心臟左心室功能的恢復(fù);整體動物實驗發(fā)現(xiàn)，氫氣可以減少缺血再灌注后心肌梗死的面積，但不改變血流動力學(xué)參數(shù)，并且可以減輕缺血再灌注損傷后病理性的左心室重塑，研究還發(fā)現(xiàn)吸入2%的氫氣能提供最顯著的保護作用。Nakao等研究了吸入氫氣和/或一氧化碳對心肌冷缺血再灌注損傷的作用，對冷缺血6或18小時的大鼠實施同基因異位心臟移植，受體和供體均于再灌注前1小時開始單獨吸入氫氣(1%～3%)或一氧化碳(0.05‰～0.25‰)或兩者共吸入2小時。結(jié)果顯示，對于6小時的冷缺血，單獨吸入氫氣(>2%)或一氧化碳(0.25‰)可以減輕心肌損傷。吸入氫氣能明顯降低血清丙二醛(MDA，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物)和高遷移率族蛋白1(HMGB1)水平，而一氧化碳能明顯抑制促炎介質(zhì)的mRNA上調(diào)。冷缺血長達18小時可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷，單獨吸入氫氣或一氧化碳均無明顯的保護作用，但聯(lián)合應(yīng)用氫氣和一氧化碳則可以明顯減輕心肌損傷，減少梗死面積，降低血清肌鈣蛋白和肌酸磷酸激酶(CPK)水平。研究表明，聯(lián)合應(yīng)用氫氣和一氧化碳可通過抗氧化和抗炎雙重機制明顯增強抗心肌損傷能力，可能成為臨床預(yù)防缺血再灌注損傷的一種有效方法。

Fukuda等通過阻斷肝左葉和左中葉的血供90分鐘、再灌注180分鐘建立了部分肝缺血再灌注損傷模型，導(dǎo)致肝細胞廣泛變性，胞質(zhì)空泡化，在缺血期的最后10分鐘開始吸入氫氣(1%～4%)190分鐘可以明顯減輕肝細胞的變性壞死，減少肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的釋放，顯著降低血清MDA水平，顯示了氫氣在肝缺血再灌注損傷中具有顯著的保護作用。

小腸缺血再灌注損傷可在許多臨床情況下發(fā)生，如腸系膜動脈阻塞、低血容量性休克、小腸移植等。缺血的小腸是許多促炎介質(zhì)的主要來源，這些_促炎介質(zhì)不僅會引起局部的小腸損傷和功能障礙，而且會引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官衰竭。Zheng等的研究表明，大鼠小腸缺血再灌注前10分鐘靜脈注射氫氣飽和生理鹽水(5mL/kg)，能顯著降低血清二胺氧化酶(DAO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)及組織MDA、髓過氧化物酶(MPO)水平，減輕小腸黏膜糜爛，腸壁滲透性增加等損傷。該小組進一步研究表明，靜脈注射氫氣飽和生理鹽水還可以抑制大鼠腸缺血再灌注后肺組織中性粒細胞浸潤，脂質(zhì)過氧化，降低TNF-α、IL-1β水平，從而減輕腸缺血再灌注后的肺損傷。

Buchholz等的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸移植術(shù)后24小時發(fā)生胃腸傳輸延遲，空腸環(huán)狀肌收縮性降低，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6及組織MDA、MPO水平升高，組織病理結(jié)果顯示腸黏膜糜爛、腸壁滲透性增加。

如果供體術(shù)前吸入2%的氫氣1小時、受體術(shù)前1小時開始吸入2%的氫氣持續(xù)至術(shù)后1小時則能顯著改善上述病理改變，促進小腸移植后腸道功能的恢復(fù)。在受體的肺組織中，吸入氫氣明顯減少了炎性因子mRNA的上調(diào)，減少了中性粒細胞浸潤，這表明氫氣不僅可以明顯減輕局部的小腸移植損傷，而且可以通過其抗氧化效應(yīng)和抗炎效應(yīng)抑制遠隔器官的損傷。

短暫的眼內(nèi)壓升高所致的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷可以通過產(chǎn)生大量的ROS導(dǎo)致神經(jīng)損傷。

Oharazawa等研究了氫氣飽和生理鹽水對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用，他們通過給大鼠升高眼內(nèi)壓60分鐘建立視網(wǎng)膜缺血模型，在缺血和再灌注過程中連續(xù)在眼睛表面滴加氫氣飽和鹽水。

結(jié)果顯示，連續(xù)給予氫氣飽和鹽水后，玻璃體內(nèi)氫氣濃度立即升高，·OH水平明顯下降。缺血再灌注后第1天，與對照組相比，視網(wǎng)膜凋亡細胞數(shù)目明顯下降，氧化應(yīng)激指標(biāo)陽性細胞數(shù)也明顯減少;缺血再灌注后第7天，與對照組相比，視網(wǎng)膜損傷情況明顯減輕，視網(wǎng)膜厚度恢復(fù)至>70%。

上述研究結(jié)果表明，在再灌注前開始吸入1%～4%的氫氣直至再灌注結(jié)束或在再灌注前開始應(yīng)用氫氣飽和生理鹽水可以明顯減輕器官的缺血再灌注損傷。

3.2　氫氣與慢性異基因移植物腎病

慢性異基因移植物腎病(CAN)是移植腎晚期功能衰竭的主要原因，其特點是進行性腎功能衰竭，臨床表現(xiàn)為腎性高血壓和蛋白尿，許多因素與之有關(guān)，包括免疫因素(如急性排斥反應(yīng))和非免疫因素(如缺血再灌注損傷)，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引起免疫應(yīng)激和非免疫應(yīng)激的共同途徑，移植物腎病的病理特點表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。氧化應(yīng)激一方面可以通過增加炎癥因子的產(chǎn)生促進間質(zhì)纖維化的形成;另一方面，通過激活炎癥信號通路，介導(dǎo)內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致腎小管萎縮。

Cardinal等研究了飲用含氫水對大鼠移植物腎病的改善效果，他們將路易鼠的腎臟移植到雙側(cè)腎臟切除的挪威鼠體內(nèi)，并于術(shù)后開始每天給移植鼠飲用氫水，持續(xù)150天。研究結(jié)果顯示，飲用氫水可以使腎臟局部及血清中分子氫的濃度升高，15分鐘時達到高峰，而長期飲用氫水并不會導(dǎo)致體內(nèi)氫的聚積。飲用氫水可以改善移植腎的功能，與飲用普通水的大鼠相比，表現(xiàn)為術(shù)后60d血尿素氮水平降低、肌酐清除率升高、蛋白尿減輕;同時，移植腎受體的存活率明顯升高。組織學(xué)分析顯示，與普通水組相比，術(shù)后60天飲用氫水組的大鼠腎小球硬化和炎癥細胞浸潤明顯減輕，間質(zhì)纖維化情況和平滑肌細胞增生也明顯改善;移植腎內(nèi)MDA及過氧亞硝酸鹽水平降低;定量RT-PCR結(jié)果顯示，氫水組術(shù)后60d移植腎內(nèi)炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、細胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)及IFN-γ的水平比普通水組明顯減低;Western blot結(jié)果顯示，氫水組的炎癥信號通路——絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的激活程度比普通水組明顯減弱。

以上結(jié)果顯示，飲用氫水可以通過抑制移植物腎病改善異基因移植腎的功能，提高移植腎受體的生存率，其機制一方面是通過氫氣的抗氧化活性減少氧化應(yīng)激介導(dǎo)的移植腎損傷;另一方面，通過減少炎癥因子的產(chǎn)生抑制間質(zhì)纖維化的形成，并抑制炎癥信號通路的激活最終阻止移植物腎病的發(fā)展。

3.3　氫氣與急性放射綜合征

急性放射綜合征(ARS)是指短時間內(nèi)受到大劑量的電離輻射后出現(xiàn)的一種嚴(yán)重疾病，它是一種全身性反應(yīng)，以造血系統(tǒng)和胃腸道的損傷最為明顯，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。電離輻射與機體內(nèi)水分子相互作用，產(chǎn)生多種活性自由基，是引起細胞損傷及死亡的最主要因素。大量研究表明，ROS，尤其是羥基自由基和過氧亞硝酸鹽，在電離輻射損傷中起主要作用。據(jù)估計，60%～70%的電離輻射損傷是由羥基自由基引起的，及時清除電離輻射產(chǎn)生的羥基自由基是防治電離輻射損傷的重要靶點。迄今為止，尚無有效性、安全性、選擇性及患者耐受性等方面均理想的輻射防護劑。

Liu等基于氫氣可以選擇性清除細胞毒性強的羥基自由基這一特征，提出了氫氣可能是很有應(yīng)用前景的、高效而特異的輻射防護劑的假說，值得進一步實驗驗證。

3.4　氫氣與敗血癥

敗血癥是重癥監(jiān)護病房(ICU)患者最常見的死亡原因，而活性氧的過度產(chǎn)生在敗血癥的發(fā)病過程中起重要作用。Xie等通過盲腸結(jié)扎加穿孔法制備了小鼠敗血癥模型，結(jié)果顯示，術(shù)后24h小鼠出現(xiàn)明顯的多器官損傷，肺MPO活性、濕干重比值及支氣管肺泡灌洗液蛋白含量均升高，血清生化指標(biāo)及組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)也升高，而術(shù)后1h和6h開始吸入2%氫氣的小鼠上述改變明顯減輕，這一作用與降低氧化產(chǎn)物、增強抗氧化酶的活性有關(guān)。

3.5　氫氣與結(jié)腸炎

葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎是人類炎癥性腸病的動物模型，表現(xiàn)為體重下降、厭食、血便及腸道炎癥的組織病理學(xué)改變。Kajiya等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給小鼠飲用DSS(5%)5d后，小鼠出現(xiàn)明顯的體重下降，結(jié)腸炎評分呈時間依賴性增長，結(jié)腸長度病理性縮短，結(jié)腸損傷部位的IL-12、TNF-α及IL-1β均升高;而在DSS溶液中添加氫氣(氫氣達到飽和濃度)可使上述損傷明顯改善。組織學(xué)分析結(jié)果顯示，炎癥細胞浸潤減少、上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞減輕，這表明氫氣可通過下調(diào)促炎因子的表達和抑制炎癥細胞的浸潤減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

3.6　氫氣與順鉑改善

順鉑(cisplatin)是目前臨床最常用的抗腫瘤化療藥物之一，但該藥呈劑量依賴性的急性腎毒性，大大限制了其臨床應(yīng)用，長期用藥可導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性腎功能衰竭及嚴(yán)重代謝紊亂等后果。目前對于順鉑引起腎毒性累積的機制尚不是十分清楚，有研究表明，氧化損傷可能是其主要原因。順鉑進入機體后可生成大量·OH和活性氧自由基，破壞細胞氧化-還原的平衡狀態(tài)，引發(fā)氧化應(yīng)激，通過細胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)、蛋白失活和DNA變性引發(fā)細胞損傷和壞死。

Nakashima-Kamimura等通過給C57BL/6CrSlc小鼠腹腔注射順鉑(17mg/kg)建立順鉑化療模型，研究結(jié)果顯示，吸入1%氫氣能明顯降低小鼠死亡率，改善體重下降，降低血肌酐和尿素氮水平及MDA水平;組織病理學(xué)結(jié)果顯示，吸入氫氣可以明顯改善腎小管上皮細胞胞漿空泡變性、管腔擴張、腎小管上皮細胞壞死等變化。研究還發(fā)現(xiàn)，給小鼠飲用含氫氣水(0.8mmol/L)也可以達到與吸入氫氣同樣的效果。有意義的是，氫氣改善在減輕順鉑腎毒性的同時，并不影響順鉑對體外癌細胞及荷瘤小鼠體內(nèi)癌細胞的抗腫瘤活性，因此，氫氣在抗腫瘤改善中也具有潛在應(yīng)用價值。

綜上所述，氫氣是一種理想的抗氧化劑。氧化應(yīng)激損傷涉及機體許多器官系統(tǒng)的多種疾病的發(fā)病過程，外源性氫氣通過選擇性清除細胞毒性極強的·OH，能對多種疾病和病理過程的氧化應(yīng)激損傷起到有效的保護作用，而且無明顯毒副效應(yīng)，加之氫氣易于制備，使用時方便、安全，在臨床醫(yī)療中有廣闊的應(yīng)用前景。