1975年，Dole 等證實(shí)高壓氫氣能抑制小鼠皮膚原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)。隨后研究人員通過(guò)富氫培養(yǎng)液對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株干預(yù)的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，氫氣對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及接種形成的種植瘤有抑制作用。本研究原代培養(yǎng)不同病例來(lái)源的人大腸腺癌細(xì)胞，探討氫氣對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及影響因素。

 
方法：大腸腺癌細(xì)胞取自30例大腸腺癌患者?；颊呔?015年11月 ～ 2017 年 7 月于山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院行大腸癌手術(shù)，病理明確診斷。其中男 15 例，女9例; 年齡 49 ～ 78 ( 64.3 ± 9.4) 歲，≤60 歲11例、＞ 60 歲13例; 腫瘤位于結(jié)10例，位于直腸14 例; Dukes A ～ B 期 8 例，C ～ D 期 16 例; Ki67 陽(yáng)性率≤70% 10 例，＞ 70% 14 例; 血漿 MDA≤3 μmol /L 14 例，＞ 3 μmol /L 10 例; 患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。術(shù)中無(wú)菌條件下取內(nèi)部無(wú)壞死的腫瘤組織，充分清洗后用胰蛋白酶反復(fù)消化。收集消化液，加入 FBS 終止消化，1 000 r /min 離心 5 min，DMEM /F12 + 2% FBS 重懸細(xì)胞，以 3 × 105 個(gè)/mL 細(xì)胞密度進(jìn)行原代培養(yǎng)。結(jié)合反復(fù)貼壁法和機(jī)械刮除法去除成纖維細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué) CK19 染色后， 24 例細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃至棕黃色陽(yáng)性顆粒，證明腫瘤均為上皮細(xì)胞來(lái)源，原代大腸腺癌細(xì)胞培養(yǎng)成功。當(dāng)細(xì)胞融合約 80% 左右時(shí)傳代，取 2 ～ 3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組給予含 10% 血清的DMEM /F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)，氫氣組給予含 10% 血清飽和氫氣( ≥0.6 mmol /L) 的DMEM /F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)。
 
兩組細(xì)胞活性、克隆數(shù)量及凋亡情況比較
對(duì)每例患者來(lái)源的細(xì)胞分別統(tǒng)計(jì)氫氣組和對(duì)照組的 OD 值，克隆數(shù)量及凋亡率，根據(jù)三項(xiàng)指標(biāo)的變化， 分為氫氣干預(yù)有效和無(wú)效細(xì)胞，分別統(tǒng)計(jì)兩類(lèi)細(xì)胞 上述三項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，氫氣組 15 例患者的原代 結(jié)腸癌細(xì)胞 OD 值、克隆數(shù)量均低于對(duì)照組( P 均 ＜ 0.05) ，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組( P ＜ 0.05) ，提示氫 氣干預(yù)有效。氫氣組 9 例患者的原代結(jié)腸癌細(xì)胞 OD 值、形成的克隆數(shù)量和細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比 較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P均 ＞ 0.05) ，提示氫氣干預(yù)無(wú)效。兩組氫氣干預(yù)有效及無(wú)效細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)比較見(jiàn)表 1、2。  
氫氣對(duì)大腸癌細(xì)胞的干預(yù)效果與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系
對(duì) 15 例氫氣干預(yù)有效的大腸癌原代細(xì)胞來(lái)源患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素分析， 結(jié)果顯示，血漿 MDA ＞ 3 μmol /L 和癌細(xì)胞 Ki67 表 達(dá)陽(yáng)性率 ＞ 70% 患者的原代癌細(xì)胞被氫氣抑制的概 率高于血漿 MDA≤3 μmol /L 和癌細(xì)胞 Ki67 表達(dá)陽(yáng)性率≤70% 患者( P 均 ＜ 0.05) ; 患者性別、年齡、腫瘤位置及 Dukes 分期對(duì)原代癌細(xì)胞是否被氫氣抑制無(wú)顯著影響( P 均 ＞ 0.05) 。見(jiàn)表 3。  
目前已知的能夠被氫氣抑制的細(xì)胞株包括人舌鱗狀上皮細(xì)胞癌( HSC-4) 、人肺腺癌( A549) 、人纖維肉瘤( HT-1080) 、Ehrlich 腹水腫瘤( EAT) 、人結(jié)直腸癌( SW480) 、鼠大腸癌細(xì)胞( Colon26) 等，以大腸癌來(lái)源的細(xì)胞株較多，提示氫氣有可能成為大腸癌患者新的抗腫瘤化學(xué)藥物。
 
全身化學(xué)治療是不適合手術(shù)切除的大腸癌患者的主要治療方法。但化療藥物的毒副作用大，如奧沙利鉑( OX) 導(dǎo)致的累積性末梢神經(jīng)障礙，術(shù)后輔助化療采用 FLOX方案的患者多出現(xiàn)腹瀉等。氫氣作為一種潛在的抗腫瘤藥物，迄今為止未發(fā)現(xiàn)其 對(duì)人體有任何毒副作用，具有廣闊的應(yīng)用前景; 但是，目前關(guān)于氫氣抗腫瘤的研究?jī)H局限于對(duì)少數(shù)幾 種細(xì)胞株的觀察，試驗(yàn)結(jié)果的適用性較差，還因?yàn)槿鄙倩颊叩男畔?，無(wú)法對(duì)臨床病理特征與氫氣抗腫瘤 效果的相關(guān)性進(jìn)行分析，尚不能為氫氣的實(shí)際應(yīng)用 提供可靠的依據(jù)。
 
本研究采集 30 例大腸腺癌患者的手術(shù)切除標(biāo) 本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，24 例培養(yǎng)成功，成 功率為80% 。污染是原代培養(yǎng)失敗的主要原因，說(shuō)明利用原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行氫氣抗癌研究具有一定的局限性。本研究觀察了氫氣對(duì) 24 例原代癌細(xì)胞活性、增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)氫氣僅對(duì) 15 例患者來(lái)源的癌細(xì)胞具有抑制作用，有效率為 62.5% 。Asada 等報(bào)道氫氣對(duì)人肝癌細(xì)胞株( HepG2) 沒(méi)有抑制作用， 提示氫氣的抗腫瘤作用受細(xì)胞株種類(lèi)的限制。本研究提示，氫氣的抗腫瘤作用會(huì)受到細(xì)胞株來(lái)源的影響，因?yàn)椴煌竽c癌患者的原代癌細(xì)胞類(lèi)似于不同來(lái)源的細(xì)胞株。本研究中氫氣有效原代癌細(xì)胞對(duì)照組的 OD 值、克隆數(shù)和凋亡率均數(shù)均高于氫氣無(wú)效對(duì)照組，也提示癌細(xì)胞本身的生物學(xué)特性是影響氫氣效果的重要因素。
 
目前認(rèn)為，清除活性氧(ROS) 、抗氧化是氫氣發(fā)揮生物學(xué)作用的主要機(jī)制，包括抗腫瘤作用。 不同腫瘤細(xì)胞的基因突變對(duì)ROS的產(chǎn)生和清除途徑有不同的影響，細(xì)胞內(nèi)ROS水平不一致可能是氫氣抗腫瘤作用出現(xiàn)差異的原因。MDA是自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中生成的一種醛類(lèi)物 質(zhì)，是ROS氧化細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，其血漿含量可間接反映組織及細(xì)胞受ROS損傷的程度。血漿 MDA 含量高的患者可能處于氧化還原失衡的狀態(tài)，有助于氫氣發(fā)揮抗腫瘤作用。目前已證實(shí)氫氣能夠降低氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi) MDA 含量。氧化/還原劑作為化療藥物治療腫瘤目前尚有爭(zhēng)議。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)受很多因素的影響，對(duì)腫瘤所起的作用也不確定。一些研究通過(guò)檢測(cè)患者的臨床指標(biāo)，如胰腺癌和肝癌患者的血漿硫氧還蛋白、腫瘤組織的抗氧化能力等預(yù)測(cè)氧化/還原劑的抗腫瘤療效。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿 MDA 能夠影響氫氣對(duì)原代癌細(xì)胞的抑制作用，提示將來(lái)可能通過(guò)檢測(cè) MDA 預(yù)測(cè)氫氣的抗腫瘤效果，篩選適合氫氣治療的大腸癌患者。
 
持續(xù)的增殖活性是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特征，很多抗腫瘤藥物通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮作用。Ki67 是反映腫瘤細(xì)胞增殖活性、判斷腫瘤侵襲能力的重要參考指標(biāo)，在臨床中廣泛應(yīng)用。 有報(bào)道稱(chēng)氫氣能夠降低腫瘤組織 Ki67 表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸腺癌組織 Ki67 表達(dá)普遍較高，以陽(yáng)性率為 70% 作為界限進(jìn)行分析，界限兩側(cè)癌細(xì)胞被氫氣抑制的概率也有顯著差別。這一結(jié)果也與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中氫氣有效15例原代癌細(xì)胞對(duì)照組的克隆數(shù)和OD 值均數(shù)均高于氫氣無(wú)效 9 例對(duì)照組相吻合。究其原因，可能與增殖旺盛的惡性腫瘤細(xì)胞增殖信 號(hào)較強(qiáng)，ＲOS 在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中具有中介作用，有利于氫氣發(fā)揮作用有關(guān)。
 
綜上所述，氫氣對(duì)原代人大腸腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，血漿MDA 含量和腫瘤 組織 Ki67 表達(dá)可能影響氫氣的臨床抗腫瘤效果。