氫氣對(duì)難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)的治療作用及機(jī)制研究

文章來(lái)源：admin發(fā)布日期：2024-06-27 09:53瀏覽次數(shù)：

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癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)是神經(jīng)科的急危重癥。目前的治療原則主要為在對(duì)癥支持治療的前提下,盡快終止癲癇發(fā)作。但是,約有三分之一的患者在經(jīng)過(guò)治療后,其癲癇發(fā)作仍然難以被控制進(jìn)而發(fā)展為難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)(refractory status epilepticus,RSE)。癲癇發(fā)作的時(shí)間越長(zhǎng),其對(duì)患者的危害越重。目前觀點(diǎn)認(rèn)為,持續(xù)的癲癇樣放電會(huì)引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡等,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,從而造成很多患者遺留不同程度的認(rèn)知功能損傷。因此,如何幫助患者盡快終止癲癇發(fā)作、如何保護(hù)神經(jīng)元和其他神經(jīng)細(xì)胞、以及如何改善發(fā)作后遺留的認(rèn)知功能損害已經(jīng)成為神經(jīng)科臨床工作中迫切需要解決的難題。研究發(fā)現(xiàn),在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型中,氫氣都可發(fā)揮保護(hù)性作用。例如腦缺血模型、帕金森病以及阿爾茨海默病模型等。氫氣具有很強(qiáng)的自由擴(kuò)散能力,可穿透血腦屏障快速擴(kuò)散到組織中,甚至可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而且作為一種抗氧化劑,氫氣能夠選擇性地減少最具細(xì)胞毒性的活性氧自由基:·OH。另外,研究表明氫氣還可發(fā)揮抗炎、調(diào)控離子通道受體等作用。例如,在治療痛覺(jué)過(guò)敏時(shí),氫氣可以抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體的亞單位NR2B的膜轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而調(diào)控NMDA受體功能,降低神經(jīng)興奮性?；跉錃獾倪@些功能特性,我們推測(cè)氫氣可能對(duì)RSE產(chǎn)生積極的治療作用。
因此,我們對(duì)氫氣在RSE中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究,期望為解決神經(jīng)科臨床中的難點(diǎn)問(wèn)題提供新的思路和理論依據(jù)。目的:1、探討氫氣治療對(duì)RSE大鼠癲癇發(fā)作的作用以及對(duì)NR2B亞基在海馬細(xì)胞膜上的表達(dá)和磷酸化水平的影響。2、探討氫氣治療對(duì)RSE導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡的影響。3、觀察氫氣治療對(duì)RSE導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害的作用。方法:1、建立大鼠難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)模型后,通過(guò)行為學(xué)評(píng)分(Racine Scores)觀察氫生理鹽水(hydrogen-rich saline,HRS)治療對(duì)模型大鼠癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度的影響,通過(guò)腦電圖(electroencephalogram,EEG)分析觀察HRS對(duì)腦電圖的波幅和功率的影響。然后利用Western blot對(duì)NR2B及p-NR2B在膜上的表達(dá)進(jìn)行研究,觀察它們?cè)谥委熀蟮淖兓?、通過(guò)免疫熒光染色、透射電鏡及Western blot等方法觀察治療后各組大鼠海馬內(nèi)細(xì)胞的死亡方式、其所在的區(qū)域以及炎癥反應(yīng)等的變化。3、通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期、在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和進(jìn)入目標(biāo)象限的頻率等指標(biāo)對(duì)各組大鼠在RSE后14天的認(rèn)知功能狀況進(jìn)行分析。結(jié)果:1、行為學(xué)Racine評(píng)分和腦電圖結(jié)果。行為學(xué)評(píng)分:與RSE+saline組的相比,RSE+HRS組的大鼠Racine評(píng)分沒(méi)有明顯的變化。腦電圖結(jié)果:與RSE+Saline組的大鼠相比,RSE+HRS組中大鼠的腦電圖波幅及功率均降低。2、NR2B表達(dá)和磷酸化水平的變化。與對(duì)照組(Con組)相比,癲癇發(fā)作后RSE組的大鼠海馬細(xì)胞膜上NR2B的表達(dá)水平和磷酸化水平均隨時(shí)間逐漸升高;NR2B的表達(dá)水平在RSE+Saline組和RSE+HRS組間沒(méi)有明顯差異,但RSE+HRS組的大鼠NR2B的磷酸化水平明顯低于RSE+Saline組。3、細(xì)胞凋亡的變化。與Con組相比,RSE組在CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)的凋亡細(xì)胞明顯增多。與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組CA1區(qū)和DG區(qū)的凋亡細(xì)胞比例下降,CA3區(qū)沒(méi)有明顯變化。更進(jìn)一步,對(duì)凋亡細(xì)胞類型的分析結(jié)果顯示,在CA1區(qū),與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組神經(jīng)元發(fā)生凋亡的比例降低,存活數(shù)量增加,而兩組間發(fā)生凋亡的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和星形膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)量均沒(méi)有差異;在DG區(qū)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中,與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組的發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例明顯降低。4、細(xì)胞壞死性凋亡的變化。(1)形態(tài)學(xué)結(jié)果提示,與Con組相比,RSE組的大鼠海馬內(nèi)發(fā)生壞死性凋亡的細(xì)胞明顯增多。Western blot結(jié)果和電鏡結(jié)果進(jìn)一步充分證實(shí)了壞死性凋亡的發(fā)生。壞死性凋亡主要分布在CA1區(qū)和DG區(qū);在CA1區(qū)內(nèi)發(fā)生壞死性凋亡的細(xì)胞主要為神經(jīng)元,而在DG區(qū)內(nèi)發(fā)生壞死性凋亡的細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞。(2)Western blot結(jié)果提示,與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組的壞死性凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)在CA1區(qū)域明顯降低,包括MLKL、p-MLKL以及RIP3等。(3)CA1區(qū)的染色結(jié)果提示,相比于Con+Saline組和Con+HRS組,在RSE+Saline組的CA1區(qū)神經(jīng)元群體中,MLKL陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多;而在RSE+HRS組,MLKL陽(yáng)性的神經(jīng)元相比RSE+Saline組有明顯減少(4)DG區(qū)的染色結(jié)果提示,在DG區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,MLKL陽(yáng)性的細(xì)胞所占比例在RSE+Saline組和RSE+HRS組中,均顯著高于Con+Saline組以及Con+HRS組,而RSE+HRS組中MLKL陽(yáng)性的細(xì)胞所占的比例又明顯低于RSE+Saline組。5、海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度的變化。RSE+Saline組和RSE+HRS組的大鼠海馬Iba1陽(yáng)性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均高于Con+HRS組和Con+Saline組的大鼠。與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組的大鼠的Iba1陽(yáng)性海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目明顯減少。6、大鼠認(rèn)知功能的改變。RSE+Saline組和RSE+HRS組的大鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于Con+HRS組和Con+Saline組的大鼠,而大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)則明顯少于Con+HRS組和Con+Saline組的大鼠。與RSE+Saline組相比,RSE+HRS組的大鼠的逃避潛伏期明顯縮短,大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)明顯增加。
結(jié)論:1、HRS治療對(duì)RSE大鼠的行為學(xué)發(fā)作評(píng)分沒(méi)有明顯影響,但可減輕RSE大鼠發(fā)作時(shí)的腦電幅度和功率;HRS治療降低了NR2B亞基的磷酸化水平。2、HRS對(duì)RSE導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡有改善作用,可減少RSE誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死性凋亡,尤其對(duì)阻止CA1區(qū)神經(jīng)元的壞死性凋亡具有很好的作用效果;HRS對(duì)海馬部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化也有明顯的減輕作用。3、HRS治療可以改善RSE引起的認(rèn)知功能損害。4、HRS既能減輕發(fā)作期RSE大鼠腦電發(fā)作,又能增加RSE后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量并改善RSE大鼠的認(rèn)知功能。這提示臨床上減輕腦電異常放電,可能具有積極的治療意義。