氫氣改善心臟驟停/心肺復(fù)蘇后大鼠心、腦損傷的作用及機(jī)制研究

文章來源：admin發(fā)布日期：2024-07-19 10:47瀏覽次數(shù)：

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心臟驟停(cardiac arrest CA)是全球主要死亡原因之一,發(fā)病急且致殘致死率高。

研究發(fā)現(xiàn),CA患者在自主循環(huán)恢復(fù)后,臨床上主要表現(xiàn)為心臟驟停后綜合征(post-cardiac arrest syndrome PCAS),主要包括以下四方面:1、CA后腦功能損害;2、CA后心肌功能障礙;3、全身性缺血再灌注損傷;4、引起CA的原發(fā)病病情變化。調(diào)查顯示,自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation ROSC)后患者主要死于全身缺血再灌注引起的心腦功能障礙,早期45%～60%的ROSC的患者將出現(xiàn)嚴(yán)重的或致死性的心肺復(fù)蘇后心肌功能障礙(post-arrest myocardial dysfunction PAMD),中晚期階段68%的ROSC患者將死于復(fù)蘇后腦損傷。因此,如何改善和提高心臟驟停的生存率及預(yù)后是亟待解決的問題。一直以來,心肌細(xì)胞以及大腦神經(jīng)元被認(rèn)為再生能力非常差。細(xì)胞程序性死亡的方式主要有三種類型:凋亡、自噬、壞死。自噬是一種早于凋亡發(fā)生的程序,具有抗凋亡和促凋亡的兩面性,可以對細(xì)胞死亡進(jìn)行調(diào)控,好似一把“雙刃劍”,這取決于細(xì)胞周圍環(huán)境的變化。種種跡象表明,再灌注后心肌細(xì)胞、神經(jīng)元自噬異常增多可能導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和腦功能損傷。早期、有效抑制自噬的發(fā)生,有可能減輕心臟驟停后心肌、腦缺血再灌注損傷,提高心臟驟停存活率及預(yù)后。氫分子作為選擇性抗氧化劑,可以自由擴(kuò)散到細(xì)胞成分中,研究發(fā)現(xiàn)氫分子減輕缺血再灌注損傷考慮與抗炎、抗氧化應(yīng)激或者抗凋亡相關(guān)。
最近分子氫與自噬關(guān)系密切,研究顯示富氫鹽可以通過降低心肌細(xì)胞mTOR、AMPK、Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)水平,抑制心肌細(xì)胞自我吞噬作用,減輕心肌缺血再灌注損傷,減少心肌梗死面積。小鼠新生缺血性腦病模型中,富氫鹽減輕腦水腫,縮小梗死面積,機(jī)制考慮與抑制神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)自噬相關(guān),發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。因而結(jié)合當(dāng)前國內(nèi)外的研究,我們主要探討氫分子治療在室息誘導(dǎo)的大鼠心臟驟停模型中心肌損傷及神經(jīng)元損傷中的作用和機(jī)制。
研究目的本課題的主要目的在于:1.研究氫氣對心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠心肌損傷的作用及其機(jī)制,.研究氫氣對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用和機(jī)制。2.研究氫氣對心臟驟停/心肺復(fù)蘇大鼠神經(jīng)元損傷的作用及其機(jī)制。研究方法(一)動物實(shí)驗(yàn)1.大鼠窒息心臟驟停/心肺復(fù)蘇模型的建立體重400-450g的雄性Wistar大鼠用于構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?首先腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物麻醉,進(jìn)行氣管插管,并連接呼吸機(jī),窒息法誘導(dǎo)心臟驟停,窒息10min后心肺復(fù)蘇,啟動呼吸機(jī),進(jìn)行人工胸外按壓(200次/分鐘),并同時靜脈注射腎上腺素(2 μg/100g,每隔3分鐘給藥一次)。心臟驟停誘導(dǎo)成功定義為:平均動脈壓(Mean arterial pressure MAP)<30mmHg;恢復(fù)自主循環(huán)(ROSC)的定義為:恢復(fù)竇性心率,MAP≥60 mmIHg,且持續(xù)5分鐘以上。ROSC后持續(xù)10min以上者入組實(shí)驗(yàn)。2.分組及給藥雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組(吸入常氧對照組:Sham-Normorxia,吸入氫氣對照組:Sham-H2,吸入常氧復(fù)蘇4小時組:CPR-4h-Normorxia,吸入氫氣復(fù)蘇4小時組:CPR-4h-H2,吸入常氧復(fù)蘇72小時組:CPR-72h-Normorxia,吸入氫氣復(fù)蘇72小時組:CPR-72h-H2),每組10只大鼠。吸入常氧和吸入氫氣對照組大鼠不進(jìn)行窒息誘導(dǎo)心臟驟停和心肺復(fù)蘇,給予機(jī)械通氣,分別吸入空氣和1.3%氫氣/空氣混合氣1小時。吸入常氧和吸入氫氣復(fù)蘇組大鼠ROSC后分別吸入空氣和1.3%氫氣/空氣混合氣1小時。3.心率、血壓監(jiān)測大鼠體表心電圖監(jiān)測心率,股動脈置管監(jiān)測平均動脈壓,監(jiān)測ROSC后30min、1h、2h心率和平均動脈壓。4.血?dú)夥治龅臋z測分別在ROSC后30min,1h,2h,4h,取股動脈血1.5ml,立即行血?dú)夥治觥?.心功能監(jiān)測利用心臟超聲心動圖測量ROSC后4h、72h左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(Left ventricular Fractional shortening,LVFS)以及左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular Ejection Fraction,LVEF)。6.血清中心肌損傷標(biāo)志物檢測分別于ROSC后4h、72h取血,將全血在4℃以1000 g條件下離心20分鐘后,收集上層血清,用ELISA試劑盒檢測心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌酸磷酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CKMB)水平。7.心肌/海馬區(qū)細(xì)胞凋亡檢測于ROSC后4h、72h處死大鼠,取左心室心肌/海馬區(qū)神經(jīng)元組織,經(jīng)過4%多聚甲醛固定后,進(jìn)行石蠟包埋、切片操作。使用TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡水平。8.心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)分析于ROSC后4h、72h處死大鼠,取左心室心肌組織,經(jīng)過戊二醛固定,使用透射電子顯微鏡進(jìn)行檢查,ImageJ用于線粒體結(jié)構(gòu)破壞的嚴(yán)重程度的半定量分析。9.心肌/海馬組織Beclin-1、LC3B和p62蛋白檢測于ROSC后4h、72h處死大鼠,取左心室/海馬勻漿提取總蛋白,隨后進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測Beclin-1、LC3B和p62蛋白。10.心肌組織/海馬組織免疫組化ROSC后4h、72h處死大鼠,取左室心肌/海馬用4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋、切片。熒光顯微鏡下觀察、拍照,通過Image J進(jìn)行分析LC3B蛋白表達(dá)情況。11.神經(jīng)功能損傷評分(NDS)大鼠ROSC后4h和72h,將大鼠從籠中取出進(jìn)行單盲NDS檢測。12.血清NSE和S100的水平的檢測分別于ROSC后4h、72h取血,將全血在4℃,1000 g條件下離心20分鐘,收集上層血清,用ELISA試劑盒檢測NSE和S100的水平。
(二)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.H9C2 低氧復(fù)氧(Hypoxia-reoxygenation,H/R)模型的建立細(xì)胞常氧培養(yǎng)條件為37℃,氣體成分為95%空氣+5%CO2。缺氧時的培養(yǎng)條件為37℃,氣體成分為 94%N2+5%C02+1%O2。在進(jìn)行細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation H/R)處理時,首先將H9C2細(xì)胞在常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時,然后轉(zhuǎn)移至低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,再轉(zhuǎn)移至常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時或12小時。2.分組及給藥細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為6組,分別是普通培養(yǎng)基對照組:Con-Vehicle,富氫培養(yǎng)基對照組:Con-H2,缺氧/復(fù)氧4小時+普通培養(yǎng)基組:H/R-4h-Vehicle,缺氧/復(fù)氧4小時+富氫培養(yǎng)基組:H/R-4h-H2,缺氧/復(fù)氧12小時+普通培養(yǎng)基組:H/R-12h-Vehicle,缺氧/復(fù)氧12小時+富氫培養(yǎng)基組:H/R-12h-H2。3.H9C2 細(xì)胞 Beclin-1、LC3B 和 p62 蛋白檢測利用Western-Blot檢測H9C2總蛋白中Beclin-1、LC3B和p62蛋白表達(dá)。4.H9C2細(xì)胞免疫熒光免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白的表達(dá)情況。5.mRFP-GFP-LC3B雙色熒光腺病毒轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3B雙色熒光腺病毒,建立H/R模型,顯微鏡下觀察,拍照;分辨,統(tǒng)計自噬小體(紅色+綠色),自噬溶酶體(紅色)的數(shù)量。
研究結(jié)果:
1.動物實(shí)驗(yàn)的基本資料和模型數(shù)據(jù)在動物實(shí)驗(yàn)方案中,CPR+H2組基線和模型數(shù)據(jù)與CPR-Normoxia組相比,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,其中包括MAP和HR,誘導(dǎo)CA時間,ROSC時間,NE用量。血?dú)夥治鼋Y(jié)果發(fā)現(xiàn)CPR-Normoxia組與CPR+H2之間也無顯著差異。
2.心肺復(fù)蘇后吸入氫氣顯著改善ROSC后大鼠的生存率和心臟功能CPR后吸入氫氣可以顯著提高ROSC后大鼠的生存率,改善ROSC后大鼠左心室心臟功能。
3.心肺復(fù)蘇后吸入氫氣顯著改善ROSC大鼠的心肌細(xì)胞死亡和線粒體損傷吸入氫氣可以減輕ROSC后大鼠血清中的CK-MB和cTnT水平,減少心肌細(xì)胞凋亡比例,減輕心肌細(xì)胞的損傷。吸入氫氣顯著改善心臟驟停/心臟驟停后大鼠心肌細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu),減少心肌細(xì)胞中的自噬小體數(shù)量。
4.心肺復(fù)蘇后吸入氫氣顯著減少心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制自噬激活Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,吸入氫氣可以顯著減少ROSC后大鼠左室心肌Beclin-1和LC3B的蛋白表達(dá)水平,顯著升高p62的蛋白表達(dá)水平。同時,免疫組化結(jié)果顯示吸入氫氣可以顯著降低大鼠左室心肌組織中LC3B的蛋白表達(dá)水平,抑制自噬的激活。
5.氫氣抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氫氣能夠顯著減少H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B的表達(dá),增加p62的蛋白表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氫氣可以抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá),抑制自噬的激活。mRFP-GFP-LC3B雙色熒光腺病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,氫氣可以抑制H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中自噬小體的形成,減少自噬小體的數(shù)量,抑制自噬的激活。
6.心肺復(fù)蘇后吸入氫氣有效改善ROSC后大鼠的神經(jīng)功能大鼠神經(jīng)功能損傷評分(NDS)數(shù)據(jù)顯示,吸入氫氣可以改善ROSC大鼠的神經(jīng)功能。ELISA結(jié)果顯示,吸入氫氣可以減少ROSC后大鼠血清中中樞神經(jīng)特異性蛋白(S100)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE)的表達(dá)水平。
7.心肺復(fù)蘇后吸入氫氣顯著減少海馬神經(jīng)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制自噬激活Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,吸入氫氣顯著減少ROSC后大鼠海馬組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B的表達(dá),增加p62的蛋白表達(dá)水平。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,吸入氫氣顯著減少ROSC后大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞中LC3B的蛋白表達(dá)水平,抑制自噬激活。

結(jié)論1.吸入氫氣能夠改善窒息誘導(dǎo)CA/ROSC大鼠的心臟和神經(jīng)功能,減輕心肌和腦損傷,提高大鼠的生存率。2.氫氣能夠顯著抑制心肌細(xì)胞和海馬區(qū)域神經(jīng)元中自噬的水平,減少心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的自噬性死亡。