研究背景和目的多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為病理特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病。多發(fā)性硬化病因不明,其發(fā)病過程與CD4+T細(xì)胞分化密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前研究多發(fā)性硬化最為適宜的模型,對(duì)于疾病發(fā)生過程中異常免疫反應(yīng)有較好模擬作用。在多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中,激活的CD4+T細(xì)胞在髓鞘抗原刺激下分化成分泌不同炎性因子的輔助型T細(xì)胞亞群(Helper T cells,Th cells)。促炎性輔助型T細(xì)胞和抑炎免疫調(diào)節(jié)型T細(xì)胞之間的免疫失衡,是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。氫氣是自然界中一種無色無味的氣體。近年來發(fā)現(xiàn)氫氣具有選擇性抗氧化作用,因?yàn)榘踩唵?可能適用于多種急慢性病的治療。由于氫氣分子量小且缺乏極性,使得氫分子具有強(qiáng)大的組織擴(kuò)散能力,可迅速穿過血腦屏障抵達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但擴(kuò)散能力強(qiáng)也容易降低氫氣的體內(nèi)存留時(shí)間和劑量,采用吸入氫氣的方法可保證在體存留時(shí)間和給氣劑量,對(duì)于發(fā)揮氫氣的治療作用有其獨(dú)特的優(yōu)勢。
本課題研究目的在于證實(shí)氫氣吸入對(duì)于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用,并探究保護(hù)作用機(jī)制。本研究主要分為三個(gè)部分:第一部分呼吸氫氣對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物的治療作用目的:中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞的浸潤和大范圍的髓鞘脫失以及軸索損傷是多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的病理學(xué)特點(diǎn)。氫氣作為一種新型抗氧化劑越來越受到人們重視。本實(shí)驗(yàn)擬采用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物為研究對(duì)象,通過給與高濃度氫氣吸入方式,探討氫氣對(duì)于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物的治療作用。
方法:建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型,采用隨機(jī)數(shù)字表法共分為4組(n=12):正常組(Ctrl組),實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組),實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組),實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎吸入氮氧混合氣組(EAE+HCN組)。EAE+HCH組和EAE+HCN組小鼠自致免后第12天開始每日吸入氫氧混合氣或氮氧混合氣2個(gè)小時(shí)。每日進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和體重稱量;致免后第21天進(jìn)行老鼠處死和組織取材的工作,采用H&E染色和勒克斯速藍(lán)(Luxol fast blue,LFB)染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)的觀察評(píng)分;采用免疫組化方法觀察脊髓中T細(xì)胞數(shù)量的變化;通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測脊髓勻漿裂解液中炎性因子含量改變。結(jié)果:與Ctrl組相比,EAE組第9天開出現(xiàn)尾部肌肉張力喪失,逐漸擴(kuò)散到單或雙下肢,同時(shí)伴隨體重下降,組織形態(tài)學(xué)觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)腰膨大部分炎性細(xì)胞浸潤和大量脫髓鞘和軸索損傷,相同切片區(qū)域中大量CD4+T細(xì)胞浸潤,脊髓裂解液中炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量升高;與EAE組相比,EAE+HCN組各種檢測指標(biāo)均未見明顯改變;與EAE組相比,EAE+HCH組神經(jīng)行為學(xué)和體重缺失有所緩解,中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘情況得到明顯改善,T細(xì)胞數(shù)量減少,炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量降低而抗炎因子IL-10含量升高。結(jié)論:氫氣吸入能改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤和脊髓髓鞘脫失,減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細(xì)胞浸潤,降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥水平。結(jié)果顯示,吸入高濃度氫氣對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎具有治療效應(yīng)。第二部分呼吸氫氣對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物免疫細(xì)胞的影響及機(jī)制探討目的:有關(guān)多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,異常免疫反應(yīng)在多發(fā)性硬化發(fā)病過程中起到重要作用。氫氣作為一種抗氧化、抗炎和抗凋亡的新型治療手段,吸入氫氣是否對(duì)免疫細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用是我們這一部分探究的內(nèi)容。通過建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物,探討氫氣對(duì)免疫細(xì)胞以及輔助型T細(xì)胞的影響。方法:建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型,采用隨機(jī)數(shù)字表法共分為兩組(n=12):實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組)。EAE+HCH組自致免后第12天開始每日吸入高濃度氫氣2個(gè)小時(shí)。實(shí)驗(yàn)第19天進(jìn)行小鼠處死和組織取材工作,將小鼠脊髓和腦以及小鼠脾臟分別制備單細(xì)胞懸液,體外MOG 35-55刺激培養(yǎng)。48小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)檢測各型免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例;收集培養(yǎng)液上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法分析細(xì)胞因子;采用RT-PCR進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄因子水平測定。結(jié)果:與EAE組相比,EAE+HCH組小鼠的CD4+T細(xì)胞和CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟細(xì)胞的數(shù)量和比例都降低,CD19+細(xì)胞的數(shù)量和比例兩組之間并無明顯差異;與EAE組相比,EAE+HCH組的Th17細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟的數(shù)量和比例均下降,ELISA顯示IL-17的含量減少,RT-PCR結(jié)果顯示RORγt表達(dá)水平下降。其他輔助型T細(xì)胞,包括Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量,以及細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子水平在兩組之間不存在差異。結(jié)論:高濃度氫氣吸入可減少CD4+T和CD11b小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟中的數(shù)量和比例;高濃度氫氣吸入可減少Th17數(shù)量和比例,減少其分泌的細(xì)胞因子以及轉(zhuǎn)錄水平。第三部分分子氫通過調(diào)節(jié)ROS/NLRP3通路發(fā)揮對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制作用目的:分泌IL-17炎性因子的Th17細(xì)胞在多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病過程中發(fā)揮非常重要的作用。NLRP3及其相關(guān)蛋白分子與多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本部分?jǐn)M采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),來探究氫氣對(duì)于Th17細(xì)胞分化的抑制作用是否通過調(diào)節(jié)ROS/NLPR3通路引起。方法:本部分研究分為兩個(gè)階段:第一階段,建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物,采用隨機(jī)數(shù)字表法共分為兩組(n=12):實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE組),實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎吸入高濃度氫氣組(EAE+HCH組),EAE+HCH組自致免后第12天開始每日吸入高濃度氫氣2個(gè)小時(shí)。另外設(shè)有正常對(duì)照組(Ctrl組,n=12)。于實(shí)驗(yàn)第19天進(jìn)行組織取材,小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行體外培養(yǎng)。48小時(shí)后采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞中DCFHDA的含量變化;采用western blot的方法檢測NLPR3相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。第二階段:從野生型小鼠脾臟制備的單細(xì)胞懸液進(jìn)行磁性負(fù)性分離na?ve T細(xì)胞,再進(jìn)行Th17細(xì)胞定向分化,分別給與ATP和(或)富氫培養(yǎng)基處理。采用流式細(xì)胞術(shù)分析Th17細(xì)胞的數(shù)量,采用western blot檢測NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
結(jié)果:與Ctrl組相比,EAE組的CD4+T細(xì)胞中ROS含量明顯上升,而氫氣吸入(EAE+HCH組)可以減少CD4+T細(xì)胞中ROS的含量。與EAE組相比,EAE+HCH組的CD4+T細(xì)胞中IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)水平下降。在體外Th17細(xì)胞定向分化過程中實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)ATP處理的Th17細(xì)胞數(shù)量增加,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)含量升高;加入富氫培養(yǎng)基處理后,Th17細(xì)胞數(shù)量減少,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論:氫氣通過減少CD4+T細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,發(fā)揮對(duì)NLRP3及其下游蛋白Caspase-1和IL-1β的抑制作用,進(jìn)一步導(dǎo)致了Th17細(xì)胞分化數(shù)量的降低。綜上所述,呼吸氫氣可改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)功能損傷和體重喪失,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和髓鞘脫失;氫氣可降低CD4+T細(xì)胞和CD11b+小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脾臟中數(shù)量和比例,減少實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物中Th17細(xì)胞數(shù)量比例及特異性炎性因子表達(dá);氫氣能夠通過降低CD4+T細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的水平,抑制NLRP3炎性小體激活和下游效應(yīng)因子表達(dá),發(fā)揮對(duì)Th17細(xì)胞分化過程抑制作用。研究結(jié)果提示,高濃度氫氣吸入作為一種給氫方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎具有治療作用,其機(jī)制可能是氫氣抗氧化抑制了NLRP3炎性小體激活和效應(yīng)因子釋放,導(dǎo)致了Th17細(xì)胞分化數(shù)量的減少,進(jìn)而緩解了免疫炎癥反應(yīng)。
