氫氣改善高同型半胱氨酸血癥中的作用及機制研究

文章來源：admin發(fā)布日期：2024-07-19 10:37瀏覽次數(shù)：

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研究背景:高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)在我國發(fā)病率較高,HHcy與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如心血管疾病、神經(jīng)和精神疾病、慢性腎病、脂肪肝等,是多種疾病的獨立危險因素。其主要通過氧化應激損傷、DNA甲基化和含硫化合物代謝異常等多種機制影響細胞功能,進而導致多種組織和器官的病理變化。目前對于HHcy的管理與治療策略,臨床上主要針對葉酸、維生素B6、維生素B12等關(guān)鍵輔酶不足的情況進行營養(yǎng)干預治療。雖然該干預措施對降低同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平的療效沒有爭議,但干預周期長以及對于疾病預后的改善普遍低于預期是其主要缺點。因此,目前亟需一種可以降低Hcy水平并且顯著改善患者預后,降低并發(fā)癥罹患風險的高效干預策略。氫醫(yī)學在近年來迅速發(fā)展,氫氣已經(jīng)被證實能對心血管疾病、慢性腎病、高血壓、代謝綜合征等疾病產(chǎn)生積極作用,并以安全、體積小、作用迅速、無毒副反應等優(yōu)點引起廣泛的關(guān)注。多種動物病理模型證實,氫氣療效顯著且無明顯不良反應,大量的研究表明,氫氣既可以直接與活性氧自由基反應減少氧化應激發(fā)揮生物學效應,又可以通過調(diào)節(jié)基因表達發(fā)揮保護效應。因此,氫氣干預在慢性代謝性疾病領域具有廣闊的應用前景。

研究目的:觀察氫氣干預對高蛋氨酸飲食所致HHcy的影響,探討氫氣降低Hcy改善肝功能的作用;利用DJ-1 KO動物和細胞模型,探討DJ-1在氫氣改善HHcy中的作用及機制,并通過PPAR-γ激動劑干預在動物和細胞水平進一步驗證其調(diào)控機制。研究內(nèi)容及方法:
1.驗證HMD對動物和細胞損傷效應(1)小鼠HHcy模型的建立:將SPF級小鼠隨機分為2組:CHOW組和HMD組,CHOW采用AIN-93G對照飼料,HMD組采用AIN-93G+2%蛋氨酸飼料,建立HHcy模型,持續(xù)12周;(2)細胞HHcy模型的建立:AML-12細胞分為四組:普食組(CHOW)、蛋氨酸組(HMD),Met培養(yǎng)液(20mmol/L,50mmol/L,100mmol/L,母液濃度為200mmol/L,使用時用DMEM:F12=1:1培養(yǎng)基做相應稀釋);(3)利用Western Blot(WB)技術(shù)檢測DJ-1及Nrf2蛋白表達;(4)利用實時熒光定量PCR(RT-q PCR)技術(shù)檢測Hcy來源及代謝關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄表達。
2.探究DJ-1對Hcy代謝的調(diào)控作用(1)DJ-1 KO動物模型:DJ-1 KO動物模型:由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司購入,繁殖后擴群,經(jīng)基因型鑒定后挑選+/+為對照組(WT),-/-為敲除組(KO);(2)DJ-1 KO細胞模型:從上海吉凱基因科技有限公司構(gòu)建慢病毒載體,感染AML-12細胞后進行鑒定敲除效率;(3)利用酶循環(huán)法檢測動物血漿及細胞同型半胱氨酸(t Hcy)的濃度;(4)利用Cell Counting Kit 8(CCK-8)法檢測AML-12細胞的各組細胞活力。3.Rog干預對DJ-1及Hcy代謝的影響(1)Rog干預細胞及動物模型構(gòu)建:使用20mmol/L的rosiglitazone培養(yǎng)AML-12細胞并檢測其對DJ-1及Hcy代謝關(guān)鍵酶的影響;(2)檢測動物肝臟功能指標和血漿脂質(zhì)代謝及t Hcy水平;(3)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE),油紅(Oil Red)染色觀察動物肝臟組織病理學改變及肝臟脂肪變性。研究結(jié)果:1.HMD對小鼠肝功能和DJ-1表達的影響(1)HMD小鼠t Hcy顯著升高、體重顯著下降、肝臟指數(shù)顯著升高;(2)HMD小鼠肝臟ALT、AST顯著升高,肝臟受損;(3)HMD小鼠肝臟TC、TG,血漿TC、TG顯著升高,肝臟脂質(zhì)代謝受損;(4)肝臟病理組織切片觀察到HMD小鼠肝臟損傷并伴有脂肪肝;(5)HMD小鼠肝臟DJ-1蛋白和m RNA表達顯著下降。2.HMD干預DJ-1 KO小鼠對Hcy代謝影響(1)DJ-1 KO小鼠更不耐受HMD,t Hcy顯著升高;(2)DJ-1 KO小鼠肝臟Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶m RNA表達顯著降低;(3)肝臟轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果表明,DJ-1 KO小鼠HMD干預后,甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝通路和Vit B6代謝顯著下調(diào);DJ-1 KO小鼠維生素合成利用和脂肪酸代謝受損,對Hcy和脂肪酸代謝能力下降。
3.DJ-1敲除對細胞內(nèi)Hcy代謝作用及機制研究(1)HMD干預細胞DJ-1蛋白和m RNA表達顯著下降,細胞活性下降,Nrf2轉(zhuǎn)錄水平顯著下降;(2)HMD干預細胞Hcy代謝合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達顯著下降,再甲基化途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達顯著下降,轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達有上升趨勢;(3)HMD干預DJ-1 KO細胞活性顯著下降,不耐受HMD;(4)DJ-1 KO細胞Nrf2 m RNA顯著下降,Hcy來源關(guān)鍵酶Mat2a轉(zhuǎn)錄表達顯著下降,再甲基化途徑關(guān)鍵酶MTR、MTHFR轉(zhuǎn)錄表達顯著下降,轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達顯著下降。
4.動物和細胞rosiglitazone干預模型的構(gòu)建及對DJ-1和Hcy代謝的影響研究(1)Rog干預下調(diào)AML-12細胞DJ-1蛋白和轉(zhuǎn)錄表達;(2)Rog干預上調(diào)AML-12細胞Nrf2,并促進Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成;(3)Rog干預導致HHcy小鼠血漿Hcy進一步升高;(4)Rog干預導致HMD小鼠肝臟代謝損傷和脂肪肝進一步加重。

研究結(jié)論:
1.HMD飲食會對小鼠造成肝臟功能損傷和脂肪肝,并顯著抑制肝臟DJ-1的表達。
2.氫可以上調(diào)DJ-1表達,DJ-1 KO細胞和小鼠不耐受HMD干預,DJ-1對Hcy的代謝具有正向調(diào)節(jié)作用。
3.DJ-1 KO小鼠GSH合成和Vit B6代謝通路受阻,Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑、再甲基化途徑減弱,提示DJ-1對Hcy代謝的關(guān)鍵作用。
4.PPAR-γ激動劑Rog具有抑制DJ-1表達,導致Hcy代謝障礙并加重HHcy癥狀的作用。