背景:創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題,在中國(guó)每年有三四百萬(wàn)人罹患TBI,占創(chuàng)傷相關(guān)的死亡人數(shù)的87%,已成為年輕人的第四大主要死亡原因。此外,老年人群中TBI的發(fā)病率正在增加。氫氣是一種無(wú)色無(wú)味的氣體,有研究證明氫氣在腦損傷和其他神經(jīng)障礙疾病中具有保護(hù)性作用,但是具體的作用機(jī)制尚不清楚。自噬指的是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解來(lái)消除細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的一組古老的進(jìn)化機(jī)制,而自噬的失調(diào)是TBI后神經(jīng)元細(xì)胞死亡的原因之一。有研究證明蘆丁通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK3β通路,清除自由基的生成及抗炎作用,從而提供對(duì)γ射線(xiàn)誘導(dǎo)的腦損傷的保護(hù)作用,因此,本課題假設(shè):氫氣通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路調(diào)控對(duì)自噬的抑制,發(fā)揮對(duì)顱腦外傷的保護(hù)作用。本研究擬采用Bend.3細(xì)胞劃痕模型,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)速度、信號(hào)通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I、Beclin-1和p62的表達(dá)水平,從自噬的角度闡明氫氣治療顱腦外傷的具體機(jī)制,進(jìn)一步探討PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用,明確氫氣通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路而抑制自噬,從而改善顱腦外傷,為氫氣治療顱腦外傷提供科學(xué)依據(jù)。目的:觀察氫氣對(duì)劃痕后的Bend.3細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及細(xì)胞形態(tài)的影響,并檢測(cè)氫氣對(duì)TBI后的信號(hào)通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I、Beclin-1和p62的表達(dá)水平的影響。
方法:培養(yǎng)Bend.3細(xì)胞,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、對(duì)照+氫氣組、TBI組、TBI+氫氣組（TBI+H2組）,TBI+氫氣+PI3K抑制組（TBI+H2+LY組）,TBI+氫氣+自噬激活組（TBI+H2+Rap組）和TBI+氫氣+自噬抑制組（TBI+H2+CQ組）。每組十孔,建模后,將對(duì)照+H2組、TBI+H2組、TBI+H2+LY組、TBI+H2+Rap組和TBI+H2+CQ組中的細(xì)胞用富氫培養(yǎng)基孵育。在氫干預(yù)的同一時(shí)期,分別用PI3K抑制劑Ly294002（20u M）和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（20u M）以及自噬抑制劑氯奎（10u M）處理TBI+H2+LY組、TBI+Rap組和TBI+H2+CQ組的細(xì)胞24小時(shí)。處理后24小時(shí),觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),并用MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖活性,采用免疫熒光方式觀察各組LC3活性,提取細(xì)胞蛋白,用Western Blot法測(cè)定p-Akt、p-GSK3β、Beclin-1、LC3-II/I及p62的表達(dá)水平。結(jié)果:培養(yǎng)4天后,b End.3細(xì)胞開(kāi)始融合、成熟,然后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),在抓撓0小時(shí)后可見(jiàn)創(chuàng)面,劃痕24小時(shí)后創(chuàng)面明顯縮小。氫處理24小時(shí)后,細(xì)胞幾乎可以重新融合并重新內(nèi)皮化。但是,PI3K抑制劑Ly294002和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)氫氣的保護(hù)作用,經(jīng)Ly294002或雷帕霉素處理后,細(xì)胞的再融合率明顯降低。而氯奎可以提高細(xì)胞的再融合率。Sham組與Sham+H2組的信號(hào)通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相關(guān)蛋白LC3-II/I和Beclin-1的表達(dá)水平差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,但與Sham組比較,TBI組的p-Akt和p-GSK3β、LC3-II/I和Beclin-1的表達(dá)水平增強(qiáng)（P<0.05）,氫氣治療上調(diào)了TBI中p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)水平并抑制了TBI中LC3-II/I和Beclin-1的表達(dá),但是p62的表達(dá)水平在各組中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與TBI+H2組比較,TBI+H2+LY組的b End.3細(xì)胞的存活率、p-Akt和p-GSK3β、p62的表達(dá)水平下降（P<0.05）,LC3-II/I和Beclin-1的表達(dá)水平增強(qiáng)（P<0.05）,而TBI+H2+Rap組的細(xì)胞存活率下降,LC3-II/I和Beclin-1的表達(dá)水平增強(qiáng)（P<0.05）,但p62的表達(dá)水平下降（P<0.05）,而TBI+H2+CQ組的細(xì)胞存活率及p62的表達(dá)水平增強(qiáng)（P<0.05）;但p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)水平在三組中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論:氫氣通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路介導(dǎo)自噬的抑制,從而改善顱腦外傷。