目的探討氫氣對氧化損傷腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制,旨為臨床上新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)的防治提供可能的治療靶點(diǎn)。
方法以人和大鼠腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株與IEC-6細(xì)胞株為研究對象,根據(jù)是否采用抗霉素A和氫氣處理,將上述細(xì)胞分為3組:抗霉素A(-)/H2(-);抗霉素A(+)/H2(-);抗霉素A(+)/H2(+),分別為對照組(antimycin A 0μg/ml,H2 0mM)、抗霉素A組(antimycinA 30μg/ml,H2 0mM)及氫氣組(antimycinA 30μg/ml,H2 0.6mM)。利用Western Blot、Real-time PCR、流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸附法實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等研究方法檢測各組以下指標(biāo):(1)氧自由基(O2-?、H2O2和?OH)水平;(2)線粒體膜電位;(3)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)和8-羥基鳥嘌呤(8-OH-G);(4)細(xì)胞凋亡率和乳酸脫氫酶(LDH)活性;(5)促炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)、抗炎癥因子(IL-10)、轉(zhuǎn)錄因子核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)及其下游靶基因(HO-1、SOD、Cat、GPx)表達(dá);(6)磷酸化Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果與抗霉素A組比較,氫氣可以顯著降低由抗霉素A誘導(dǎo)的氧化損傷,表現(xiàn)為降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平(O2-?、H2O2和?OH分別為抗霉素A組的0.236倍、0.456倍和0.124倍),使線粒體膜電位升高,顯著降低細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物的含量,而且降低細(xì)胞的凋亡率(對照組、抗霉素A組、氫氣組細(xì)胞凋亡率分別為5.8%、60.1±5.89%、23.7±3.48%)及乳酸脫氫酶(LDH)活性。另外,氫氣處理可以降低甲萘醌和Fenton反應(yīng)誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的凋亡率及乳酸脫氫酶活性。最后,氫氣處理可以增加轉(zhuǎn)錄因子Nrf2磷酸化水平,并且氫氣組中炎癥因子的含量較抗霉素A組顯著下降。在抗霉素A組中,Nrf2下游基因HO-1,SOD,Cat,GPx的表達(dá)都有所升高,而氫氣的處理使轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下游靶基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。
結(jié)論氫氣能夠降低抗霉素A誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的氧化損傷,表現(xiàn)為降低了細(xì)胞內(nèi)活性自由基含量,修復(fù)線粒體膜電位,降低氧化代謝產(chǎn)物,抑制細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性。氫氣的這一保護(hù)作用可能是通過調(diào)控Nrf2-ARE信號通路實(shí)現(xiàn)的。
