研究背景:高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)在我國(guó)發(fā)病率較高,HHcy與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如心血管疾病、神經(jīng)和精神疾病、慢性腎病、脂肪肝等,是多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其主要通過氧化應(yīng)激損傷、DNA甲基化和含硫化合物代謝異常等多種機(jī)制影響細(xì)胞功能,進(jìn)而導(dǎo)致多種組織和器官的病理變化。目前對(duì)于HHcy的管理與治療策略,臨床上主要針對(duì)葉酸、維生素B6、維生素B12等關(guān)鍵輔酶不足的情況進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)治療。雖然該干預(yù)措施對(duì)降低同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平的療效沒有爭(zhēng)議,但干預(yù)周期長(zhǎng)以及對(duì)于疾病預(yù)后的改善普遍低于預(yù)期是其主要缺點(diǎn)。因此,目前亟需一種可以降低Hcy水平并且顯著改善患者預(yù)后,降低并發(fā)癥罹患風(fēng)險(xiǎn)的高效干預(yù)策略。氫醫(yī)學(xué)在近年來迅速發(fā)展,氫氣已經(jīng)被證實(shí)能對(duì)心血管疾病、慢性腎病、高血壓、代謝綜合征等疾病產(chǎn)生積極作用,并以安全、體積小、作用迅速、無毒副反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)引起廣泛的關(guān)注。多種動(dòng)物病理模型證實(shí),氫氣療效顯著且無明顯不良反應(yīng),大量的研究表明,氫氣既可以直接與活性氧自由基反應(yīng)減少氧化應(yīng)激發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),又可以通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。因此,氫氣干預(yù)在慢性代謝性疾病領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)氫氣干預(yù)可以達(dá)到降低HHcy大鼠的血漿Hcy水平和改善脂肪肝的效果,并通過組學(xué)篩選到表達(dá)差異基因PARK7(DJ-1)和甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸通路參與其中,氫干預(yù)后DJ-1表達(dá)顯著上調(diào),甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸通路顯著激活,但其具體機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。研究目的:觀察氫氣干預(yù)對(duì)高蛋氨酸飲食所致HHcy的影響,探討氫氣降低Hcy改善肝功能的作用;利用DJ-1 KO動(dòng)物和細(xì)胞模型,探討DJ-1在氫氣改善HHcy中的作用及機(jī)制,并通過PPAR-γ激動(dòng)劑干預(yù)在動(dòng)物和細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證其調(diào)控機(jī)制。
研究?jī)?nèi)容及方法:1.驗(yàn)證HMD對(duì)動(dòng)物和細(xì)胞損傷效應(yīng)(1)小鼠HHcy模型的建立:將SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為2組:CHOW組和HMD組,CHOW采用AIN-93G對(duì)照飼料,HMD組采用AIN-93G+2%蛋氨酸飼料,建立HHcy模型,持續(xù)12周;(2)細(xì)胞HHcy模型的建立:AML-12細(xì)胞分為四組:普食組(CHOW)、蛋氨酸組(HMD),Met培養(yǎng)液(20mmol/L,50mmol/L,100mmol/L,母液濃度為200mmol/L,使用時(shí)用DMEM:F12=1:1培養(yǎng)基做相應(yīng)稀釋);(3)利用Western Blot(WB)技術(shù)檢測(cè)DJ-1及Nrf2蛋白表達(dá);(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)技術(shù)檢測(cè)Hcy來源及代謝關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。2.探究DJ-1對(duì)Hcy代謝的調(diào)控作用(1)DJ-1 KO動(dòng)物模型:DJ-1 KO動(dòng)物模型:由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司購(gòu)入,繁殖后擴(kuò)群,經(jīng)基因型鑒定后挑選+/+為對(duì)照組(WT),-/-為敲除組(KO);(2)DJ-1 KO細(xì)胞模型:從上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司構(gòu)建慢病毒載體,感染AML-12細(xì)胞后進(jìn)行鑒定敲除效率;(3)利用酶循環(huán)法檢測(cè)動(dòng)物血漿及細(xì)胞同型半胱氨酸(t Hcy)的濃度;(4)利用Cell Counting Kit 8(CCK-8)法檢測(cè)AML-12細(xì)胞的各組細(xì)胞活力。3.Rog干預(yù)對(duì)DJ-1及Hcy代謝的影響(1)Rog干預(yù)細(xì)胞及動(dòng)物模型構(gòu)建:使用20mmol/L的rosiglitazone培養(yǎng)AML-12細(xì)胞并檢測(cè)其對(duì)DJ-1及Hcy代謝關(guān)鍵酶的影響;(2)檢測(cè)動(dòng)物肝臟功能指標(biāo)和血漿脂質(zhì)代謝及t Hcy水平;(3)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE),油紅(Oil Red)染色觀察動(dòng)物肝臟組織病理學(xué)改變及肝臟脂肪變性。研究結(jié)果:1.HMD對(duì)小鼠肝功能和DJ-1表達(dá)的影響(1)HMD小鼠t Hcy顯著升高、體重顯著下降、肝臟指數(shù)顯著升高;(2)HMD小鼠肝臟ALT、AST顯著升高,肝臟受損;(3)HMD小鼠肝臟TC、TG,血漿TC、TG顯著升高,肝臟脂質(zhì)代謝受損;(4)肝臟病理組織切片觀察到HMD小鼠肝臟損傷并伴有脂肪肝;(5)HMD小鼠肝臟DJ-1蛋白和m RNA表達(dá)顯著下降。2.HMD干預(yù)DJ-1 KO小鼠對(duì)Hcy代謝影響(1)DJ-1 KO小鼠更不耐受HMD,t Hcy顯著升高;(2)DJ-1 KO小鼠肝臟Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶m RNA表達(dá)顯著降低;(3)肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果表明,DJ-1 KO小鼠HMD干預(yù)后,甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝通路和Vit B6代謝顯著下調(diào);DJ-1 KO小鼠維生素合成利用和脂肪酸代謝受損,對(duì)Hcy和脂肪酸代謝能力下降。3.DJ-1敲除對(duì)細(xì)胞內(nèi)Hcy代謝作用及機(jī)制研究(1)HMD干預(yù)細(xì)胞DJ-1蛋白和m RNA表達(dá)顯著下降,細(xì)胞活性下降,Nrf2轉(zhuǎn)錄水平顯著下降;(2)HMD干預(yù)細(xì)胞Hcy代謝合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降,再甲基化途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降,轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)有上升趨勢(shì);(3)HMD干預(yù)DJ-1 KO細(xì)胞活性顯著下降,不耐受HMD;(4)DJ-1 KO細(xì)胞Nrf2 m RNA顯著下降,Hcy來源關(guān)鍵酶Mat2a轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降,再甲基化途徑關(guān)鍵酶MTR、MTHFR轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降,轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成途徑關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降。4.動(dòng)物和細(xì)胞rosiglitazone干預(yù)模型的構(gòu)建及對(duì)DJ-1和Hcy代謝的影響研究(1)Rog干預(yù)下調(diào)AML-12細(xì)胞DJ-1蛋白和轉(zhuǎn)錄表達(dá);(2)Rog干預(yù)上調(diào)AML-12細(xì)胞Nrf2,并促進(jìn)Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑和GSH合成;(3)Rog干預(yù)導(dǎo)致HHcy小鼠血漿Hcy進(jìn)一步升高;(4)Rog干預(yù)導(dǎo)致HMD小鼠肝臟代謝損傷和脂肪肝進(jìn)一步加重。

研究結(jié)論:1.HMD飲食會(huì)對(duì)小鼠造成肝臟功能損傷和脂肪肝,并顯著抑制肝臟DJ-1的表達(dá)。2.氫可以上調(diào)DJ-1表達(dá),DJ-1 KO細(xì)胞和小鼠不耐受HMD干預(yù),DJ-1對(duì)Hcy的代謝具有正向調(diào)節(jié)作用。3.DJ-1 KO小鼠GSH合成和Vit B6代謝通路受阻,Hcy代謝轉(zhuǎn)硫途徑、再甲基化途徑減弱,提示DJ-1對(duì)Hcy代謝的關(guān)鍵作用。4.PPAR-γ激動(dòng)劑Rog具有抑制DJ-1表達(dá),導(dǎo)致Hcy代謝障礙并加重HHcy癥狀的作用。