研究背景放射性口腔黏膜炎(Radiation Induced Oral Mucositis,RIOM)是腫瘤放療過(guò)程中,因放射線的電離輻射引起的口腔黏膜炎性或潰瘍性病變,是頭頸部腫瘤放射治療中,最常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前被廣泛接受的RIOM病理生理機(jī)制為S T.Sonis在2004年提出的五階段理論。然而,多年來(lái)基于五階段理論的臨床治療方案,并不能有效預(yù)防和抑制RIOM的發(fā)生和發(fā)展。這說(shuō)明在此病理機(jī)制之外,還存在著其他未知的調(diào)控機(jī)制。為了深入了解RIOM的病理機(jī)制,我們使用自主設(shè)計(jì)的放射防護(hù)裝置,建立了小鼠RIOM模型。在對(duì)小鼠RIOM觀察研究的過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn),即使對(duì)非放射部位進(jìn)行了有效防護(hù),放射線處理的小鼠除出現(xiàn)RIOM的癥狀之外,還出現(xiàn)了不明原因的腹瀉癥狀?？谇蛔鳛橄赖钠鹗级?口腔黏膜和胃腸道黏膜皆為全身黏膜免疫的重要組份。口腔黏膜免疫的失衡改變有可能會(huì)導(dǎo)致包括胃腸道黏膜免疫在內(nèi)的機(jī)體黏膜免疫平衡的破壞。反之,胃腸道等口腔黏膜之外的黏膜免疫變化也會(huì)影響口腔的黏膜免疫。隨著微生物組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,近些年的臨床和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,腸道菌群可被視為黏膜免疫的重要組成部分,腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化對(duì)人類(lèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用,可影響著全身多種疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸,然而,其是否對(duì)RIOM的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生影響尚不清楚。富氫水(Hydrogen-rich Water,HW)是富含大量氫分子的水溶液,近些年來(lái)被認(rèn)為是治療炎癥性疾病的可行策略,具有良好的臨床應(yīng)用前景。HW對(duì)于氧化應(yīng)激異常導(dǎo)致的疾病有良好的治療效果。比如:神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、運(yùn)動(dòng)損傷等。而氧化應(yīng)激在放射性口腔黏膜炎的發(fā)病機(jī)制中也扮演了重要角色。因此,我們嘗試探索富氫水對(duì)于放射性口腔黏膜炎的治療效果。有研究表明,富氫水能通過(guò)增加腸道有益菌的豐度、改善菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)腸道菌群微生態(tài)平衡的恢復(fù),而腸道菌群是腸道黏膜免疫的重要組成部分。因此,本研究旨在初步探討飲用富氫水對(duì)放射性口腔黏膜組織的保護(hù)作用,并研究這種保護(hù)作用是否與富氫水調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)的能力有關(guān)。本研究?jī)?nèi)容為深入了解放射性口腔黏膜炎和腸道菌群以及胃腸道黏膜免疫的關(guān)系、探索有效的放射性口腔黏膜炎的治療方法提供新的理論依據(jù)及思路。第一章 放射性口腔黏膜炎動(dòng)物模型的建立目的自主設(shè)計(jì)用于小鼠放射的固定及放射保護(hù)裝置;探索構(gòu)建放射性口腔黏膜炎動(dòng)物模型的合適放射劑量和時(shí)間,并觀察比較小鼠RIOM進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化情況。
方法1、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AutoCAD、SoildWorks、Maya以及3DMax等軟件,設(shè)計(jì)小鼠放射的固定及放射保護(hù)裝置。使用高精度3D打印機(jī),選用亞光面、高質(zhì)量光敏樹(shù)脂材料打印小鼠放射的固定及保護(hù)裝置;2、使用不同放射劑量輻射,構(gòu)建小鼠放射性口腔黏膜炎模型:將12只6周齡的C57BL/6J雌性小鼠分為空白對(duì)照組、7Gy組、10Gy組、15Gy組共4組。麻醉小鼠后,取仰臥位固定于放射防護(hù)裝置上,分別給予相應(yīng)放射劑量以制備放射性口腔黏膜炎。于放射處理后每間隔1天,稱(chēng)量小鼠體重并連續(xù)觀察小鼠舌體黏膜組織情況;3、標(biāo)本數(shù)據(jù)收集:14天處死各組小鼠2只,獲取舌體前端組織和結(jié)腸組織。獲取固定組織后,進(jìn)行組織病理學(xué)HE染色。結(jié) 果1、在射線輻照過(guò)程中,使用自主設(shè)計(jì)、3D打印的小鼠固定及放射防護(hù)裝置可以良好的固定小鼠的體位,并對(duì)非照射部位有良好的防護(hù)作用;2、放射處理后14天,7Gy組小鼠舌體黏膜組織無(wú)明顯變化,10Gy組小鼠舌體黏膜組織前緣出現(xiàn)明顯斑片狀潰瘍,15Gy組舌體黏膜組織前緣出現(xiàn)大面積的鮮紅色潰瘍面。3、在VRTOG評(píng)分表中,7Gy和10Gy組3期口腔黏膜炎的持續(xù)時(shí)間無(wú)明顯的差異(P>0.05),而15Gy組3期口腔黏膜炎的持續(xù)時(shí)間相較于各組均有顯著差異(*P<0.05);4、和空白對(duì)照組相比,15Gy輻照組中的小鼠體重出現(xiàn)明顯波動(dòng),在放射后的前7天,兩組小鼠體重?zé)o明顯變化,放射后的第11-15天,15Gy輻照組組小鼠體重明顯下降(*P<0.05),第15-21天,15Gy輻照組組小鼠體重逐漸恢復(fù),與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異;5、放射后的第14天,15Gy輻照組組小鼠出現(xiàn)明顯的舌體黏膜組織損傷。14天取材的小鼠舌體黏膜組織HE染色結(jié)果顯示:15Gy輻照組組小鼠舌體黏膜出現(xiàn)明顯潰瘍癥狀:上皮層局部出現(xiàn)壞死脫落;上皮層連續(xù)性中斷。在腸道組織HE染色結(jié)果顯示,和空白對(duì)照組相比,15Gy輻照組組的腸道黏膜表現(xiàn)出明顯的炎癥癥狀,杯狀細(xì)胞減少,腺體管狀結(jié)構(gòu)損壞,固有層可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);結(jié)論采用自主設(shè)計(jì)的小鼠固定及放射保護(hù)裝置,可以良好的固定和保護(hù)小鼠非放射部位的組織,并充分暴露輻射部位;使用15Gy單次放射的輻照方案能夠較好的模擬RIOM部分臨床病理特征,為后續(xù)RIOM的治療藥物的選用與評(píng)價(jià)提供了有效工具。第二章飲用富氫水對(duì)小鼠電離輻射后口腔黏膜的保護(hù)作用目 的通過(guò)已建立的小鼠RIOM模型,采用飲用富氫水的方式,研究富氫水對(duì)小鼠RIOM的影響,并初步探索放射對(duì)于小鼠基因表達(dá)的影響。
方法1、構(gòu)建小鼠放射性口腔黏膜炎模型并給予富氫水飲用:將18只小鼠隨機(jī)分為3組,分別為單純輻照(RI)組、輻照后富氫水飲用(RI+HW)組和空白對(duì)照(Con)組。Con組不給予放射處理,RI組和RI+HW組采用15Gy單次放射的方案,建立放射性口腔黏膜炎模型。輻照后RI+HW組每日給予富氫水飲用,Con組和RI組于相同時(shí)間點(diǎn)更換等量正常飲用水。2、標(biāo)本數(shù)據(jù)收集:連續(xù)檢測(cè)小鼠體重變化;14天處死各組小鼠2只,獲取發(fā)生RIOM小鼠舌體潰瘍部位的組織和結(jié)腸組織,以及Con組小鼠舌體與之相對(duì)應(yīng)部位的組織;21天時(shí)處死剩余小鼠,收集結(jié)腸、肝臟、腎臟、脾臟、心臟。各臟器使用電子秤稱(chēng)重,結(jié)腸行長(zhǎng)度測(cè)量。組織固定、包埋,切片、HE染色和Masson染色。3、差異表達(dá)基因的分析:在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中以“radiation exposure”為關(guān)鍵詞,搜索數(shù)據(jù)集,Entry type 設(shè)定為“Series”,Organisms 設(shè)定為“Mus musculus”,Experiment type設(shè)定為“Expression profiling by array”,Attribute name設(shè)定為“tissue”篩選數(shù)據(jù)集:GSE33172中的GSM821295至GSM821301以及GSM821307至GSM821312。通過(guò)R-studio軟件計(jì)算錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)和表達(dá)倍數(shù)變化(foldchange)。依據(jù)FDR<0.05且| log2(fold change)|>1為篩選標(biāo)準(zhǔn),篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的差異基因DEGs。利用GO分析方法和KEGG分析方法,明確DEGs富集的生物學(xué)功能及其代謝路徑。結(jié) 果1、RI組和RI+HW組的小鼠在接受放射后14天,均出現(xiàn)口腔黏膜炎癥狀,其中RI+HW組小鼠的黏膜炎癥嚴(yán)重程度和累及范圍明顯較RI組輕。RI+HW組的小鼠體重減輕幅度也明顯低于RI組(*P<0.05);此外RI+HW組小鼠相較于RI組,3期口腔黏膜炎的持續(xù)時(shí)間顯著縮短(**P<0.01);2、HE染色結(jié)果顯示,RI組小鼠舌體黏膜組織的上皮層剝脫;上皮下層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色結(jié)果顯示:舌體黏膜組織紅色的上皮層連續(xù)性中斷。HE染色和Masson染色的結(jié)果顯示,在同一時(shí)間點(diǎn),RI+HW組可見(jiàn)同樣的舌體黏膜組織炎癥及潰瘍,但是潰瘍范圍及程度較RI組減小。3、RI組小鼠各臟器的重量和RI+HW組比較,無(wú)顯著差異,而在結(jié)腸長(zhǎng)度上,RI組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度顯著小于RI+HW組(*P<0.05)。腸道組織HE染色結(jié)果顯示,RI組小鼠腸道黏膜層上皮完整性破壞,局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而RI+HW組小鼠的腸道組織未見(jiàn)明顯的異常變化。4、對(duì)數(shù)據(jù)集中Con組和RI組的差異基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果顯示與Con組相比,RI組DEGs集中在炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)激活和細(xì)胞遷移方面;而在KEGG富集分析中,兩者的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)IgA的生成通路出現(xiàn)明顯差異(*P<0.05);結(jié)論富氫水能夠有效降低小鼠放射性口腔黏膜炎重癥(等級(jí)3)的持續(xù)時(shí)間并有效減輕放射導(dǎo)致的口腔黏膜組織病變。這有利于減弱放射導(dǎo)致的小鼠舌體黏膜組織的損傷,緩解疾病表征。此外,富氫水還能夠一定程度上緩解小鼠結(jié)腸內(nèi)的炎癥程度。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,輻照可能導(dǎo)致腸道內(nèi)黏膜免疫能力的改變。這意味著富氫水可能通過(guò)調(diào)控腸黏膜免疫,減弱RIOM的嚴(yán)重程度,并促進(jìn)RIOM的恢復(fù)。第三章富氫水對(duì)電離輻射后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響目 的通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)分別對(duì)RI組、RI+HW組和Con組小鼠的腸道菌群進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析,從腸道菌群角度探討富氫水治療放射性口腔黏膜炎的潛在機(jī)制。方 法1、小鼠糞便收集:將18只小鼠隨機(jī)分為3組,處理?xiàng)l件同第二章。每日定時(shí)收集各組小鼠糞便,液氮速凍,置于-80℃冰箱暫存;2、腸道菌群16s rRNA測(cè)序:采用二代測(cè)序技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3 V4區(qū)段基因,通過(guò)Illuminate Hiseq平臺(tái)測(cè)序。3、使用生物信息學(xué)分析方法對(duì)Con組、RI組和RI+HW組腸道菌群進(jìn)行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和組間顯著性差異分析。結(jié) 果1、腸道菌群Alpha多樣性分析:接受輻照的第1天,三組間的α多樣性指數(shù)并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。接受輻射的第13天,三組間的α多樣性指數(shù)出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2、腸道菌群Beta多樣性分析:RI+HW組和RI組在輻照后的第7-9天,兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)的Beta多樣性出現(xiàn)顯著差異。在輻照后第5天,RI組、RI+HW組和Con組腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成無(wú)明顯差異(P=0.152)。在輻照后的第9天,三組間腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成出現(xiàn)顯著差異(P=0.001)。3、腸道菌群LEfSe分析:輻照后第9天,RI組和RI+HW組間共存在21種特征性物種差異;第13天,RI組和RI+HW組間共存在11種特征性物種差異。其中雙歧桿菌屬(Biofidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacilus)、土桿菌屬(Turicibacterales)、理研菌屬(Rikenella)和芽孢桿菌綱(Bacilli)富集在RI+HW組。對(duì)部分特征性差異物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),多爾氏菌屬(Dorea)和鏈球菌屬(Streptococcaceae)的含量在R組中逐漸升高,而RI+HW組中則無(wú)明顯變化且含量和空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。結(jié)論放射性口腔黏膜炎可導(dǎo)致機(jī)體黏膜免疫的改變。富氫水可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),改善腸道微生物群的多樣性和維持腸道微生物的穩(wěn)定性,阻止輻射導(dǎo)致的全身性低度炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展;另一方面富氫水可抑制有害菌群的增多,糾正腸道菌群的失衡,減輕由于輻射導(dǎo)致的黏膜免疫失調(diào),有利于放射性口腔黏膜炎的恢復(fù)。
10.27003/d.cnki.gojyu.2022.000583
