目的:探討氫氣（H2）通過(guò)提高過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（PGC-1α）的表達(dá)保護(hù)線粒體功能改善心肌缺血再灌注損傷。心肌梗死（MI）是由于嚴(yán)重和持續(xù)的心肌缺血引起的不可逆心肌細(xì)胞損傷,通常由于心臟冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂或侵蝕而發(fā)生,從而引發(fā)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成引起閉塞。MI進(jìn)一步引起心力衰竭是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。從MI中挽救缺血心肌的唯一方法是及時(shí)再灌注治療。然而,心肌再灌注的同時(shí)也會(huì)加重心肌損傷,這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。擬研究H2的應(yīng)用以依賴于PGC-1α的方式減輕心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,激活線粒體融合并抑制線粒體分裂來(lái)減輕MIRI。 方法:通過(guò)蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)凋亡標(biāo)志物（Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl2）、炎癥因子（IL-1β、TNF-α）、線粒體裂變（DRP1、MFF）和線粒體融合（MFN1、MFN2、OPA1）相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。HE染色觀察H2對(duì)缺血再灌注（I/R）損傷心肌組織結(jié)構(gòu)的影響。透射電子顯微鏡（TEM）下觀察心肌組織I/R損傷后線粒體結(jié)構(gòu)的改變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q PCR）檢測(cè)I/R損傷以及I/R損傷經(jīng)H2治療后大鼠心肌組織PGC-1α的表達(dá)。TUNEL測(cè)定法觀察H9C2細(xì)胞的死亡率,CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定（ROS）反應(yīng)H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。免疫熒光法檢測(cè)促凋亡因子細(xì)胞色素C（Cyt-c）釋放水平。

結(jié)果:通過(guò)Western Blot檢測(cè)凋亡標(biāo)志物Bax、Cleaved Caspase-3及Bcl2的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)MIRI后促進(jìn)凋亡標(biāo)志物Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)升高,抑制凋亡標(biāo)志物Bcl2的表達(dá)下降,而H2的使用可逆轉(zhuǎn)以上結(jié)果。HE染色觀察到H2可改善I/R損傷對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)的影響。TEM觀察到心肌組織在I/R損傷后線粒體結(jié)構(gòu)的改變可被H2逆轉(zhuǎn)。以上實(shí)驗(yàn)可證明H2對(duì)MIRI具有治療效果。q PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)I/R損傷可刺激大鼠心肌組織PGC-1α的表達(dá),而H2的使用使PGC-1α表達(dá)水平進(jìn)一步升高。TUNEL測(cè)定法觀察H9C2細(xì)胞的死亡率,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷HR損傷后,H9C2細(xì)胞死亡率超過(guò)80%,H2的治療可明顯降低細(xì)胞死亡率,而PGC-1α的缺失可重新激活死亡。通過(guò)CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞活力因HR損傷而明顯降低,在H2干預(yù)后恢復(fù)到接近正常水平,并且H2的保護(hù)作用在PGC-1α缺失的細(xì)胞中被消除。此外,通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HR損傷升高了促凋亡標(biāo)志物Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá),而H2治療以依賴于PGC-1α的方式阻止了Bax、Caspase-3的激活。HR損傷同時(shí)可降低抑制凋亡標(biāo)志物Bcl2的表達(dá),H2以依賴PGC-1α的方式重新激活Bcl2。繼續(xù)使用Western Blot檢測(cè)HR損傷后細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著增加,而H2治療有效抑制了炎癥反應(yīng),這種效果是通過(guò)提高PGC-1α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,PGC-1α的缺失可抑制H2的治療效果。此外,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ROS證明了HR損傷引起H9C2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,并被H2逆轉(zhuǎn)至接近正常水平。然而,當(dāng)PGC-1α缺失時(shí),H2的治療未能減弱ROS產(chǎn)生。通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)促凋亡因子Cyt-c的釋放水平,發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞經(jīng)歷HR損傷后,細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中出現(xiàn)了更多的Cyt-c,H2的使用則有效抑制了Cyt-c的釋放,而PGC-1α的缺失消除了H2的有益作用。隨后,使用Western Blot檢測(cè)了線粒體裂變和線粒體融合相關(guān)蛋白的表達(dá),促裂變蛋白（DRP1、MFF）的表達(dá)在HR處理的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào),而促融合因子（MFN1、MFN2、OPA1）的表達(dá)水平在HR損傷下顯著下調(diào),H2治療增強(qiáng)了促融合蛋白表達(dá)的同時(shí)降低了促裂變蛋白的表達(dá)水平,PGC-1α的缺失消除了H2對(duì)線粒體融合和裂變的調(diào)節(jié)作用。
結(jié)論:H2的應(yīng)用可減輕心肌I/R損傷;PGC-1α的缺失減弱H2對(duì)I/R心臟的保護(hù)作用;H2通過(guò)作用于PGC-1α改善HR損傷下的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激;H2可發(fā)揮保護(hù)線粒體功能,這種作用在HR損傷的條件下被PGC-1α缺失消除。