高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及氫氣對肺的氧化損傷的防治研究

文章來源：admin發(fā)布日期：2024-10-21 10:05瀏覽次數(shù)：

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第一部分:高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制研究疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動,是臨床上最常見的癥狀之一,并可造成器官功能障礙。劇烈和長期的疼痛會影響到人體各器官系統(tǒng)的功能,如引起睡眠障礙、消化功能受抑制、血壓升高、心率加快(有心臟病者可致心率失常)、呼吸急促(胸、腹部疼痛時通氣受限)、植物神經(jīng)功能紊亂、關(guān)節(jié)功能下降和心理障礙等,造成藥物濫用、自殺等社會問題。如何進(jìn)行安全、有效的鎮(zhèn)痛,對減輕病人痛苦、提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。雖然高壓氧(HBO)尚未用于臨床鎮(zhèn)痛,但已有多個臨床觀察發(fā)現(xiàn)HBO的鎮(zhèn)痛效應(yīng),包括對復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征、纖維肌痛、慢性骨髓炎、偏頭痛和叢集性頭痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)等。
本課題重點研究高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及機(jī)制。

在本研究的第一部分,我們發(fā)現(xiàn),單次的HBO處理可產(chǎn)生急性鎮(zhèn)痛作用,且鎮(zhèn)痛效果和氧氣的壓力之間存在顯著的線性關(guān)系。我們進(jìn)一步研究單次HBO處理誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的時程特點,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在暴露后即刻、10 min、30 min、60 min和90 min后,高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)都可以保持在80%左右。120分鐘后下降到50%以下,在180分鐘時下降到20%左右。更有意義的是,給予小鼠每天1個小時的HBO處理,連續(xù)給予4次后,可以誘導(dǎo)獨特的雙相鎮(zhèn)痛效應(yīng):(1)早期鎮(zhèn)痛:HBO處理后1小時后出現(xiàn),持續(xù)約8小時;(2)晚期鎮(zhèn)痛:早期鎮(zhèn)痛1天后開始出現(xiàn),持續(xù)時間長達(dá)近3周。在研究的第二部分,我們重點研究了NOS在高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用。首先,我們在HBO暴露結(jié)束后分別給予小鼠非特異性NOS抑制劑、n NOS抑制劑、e NOS抑制劑和i NOS抑制劑,然后觀察它們對單次高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),非特異性NOS抑制劑和n NOS抑制劑都顯著抑制了高壓氧的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。另外,單次給予非特異性NOS抑制劑和n NOS抑制劑都顯著抑制了反復(fù)HBO處理誘導(dǎo)的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng),而持續(xù)給予非特異性NOS抑制劑和n NOS抑制劑顯著抑制了反復(fù)HBO處理誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在NOS基因敲除小鼠中,只有n NOS基因敲除小鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)得到了顯著抑制。此外,我們發(fā)現(xiàn)HBO暴露1小時后,皮層、腦干和脊髓中的NO含量顯著增高。而當(dāng)小鼠反復(fù)HBO暴露后休息7天后,在各個腦組織內(nèi),高壓氧氣暴露組的NO含量無顯著變化。最后,Western blot結(jié)果顯示,小鼠暴露于高壓氧氣后,小腦、腦干和脊髓的n NOS的含量顯著增高。在研究的第三部分,我們重點研究GABA受體和5-HT1A受體在其中的作用。我們首先研究了GABA受體拮抗劑對單次HBO處理引起的鎮(zhèn)痛作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室注射GABAA受體拮抗劑引起鎮(zhèn)痛效應(yīng)的劑量相關(guān)性降低,而側(cè)腦室注射GABAB受體抑制劑對單次HBO處理引起的鎮(zhèn)痛作用幾乎沒有影響。對于反復(fù)HBO處理,末次HBO處理3小時后進(jìn)行側(cè)腦室注射GABAA受體抑制劑和GABAB受體抑制劑,其對HBO處理誘導(dǎo)的早、晚期鎮(zhèn)痛作用無顯著影響,而在末次HBO處理7天后進(jìn)行側(cè)腦室注射GABAB受體抑制劑,則引起了高壓氧的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)的顯著下降,說明:(1)GABAA受體可能參與了單次HBO暴露誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng);(2)GABAA受體和GABAB受體可能都沒有參與反復(fù)HBO暴露誘導(dǎo)的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng);(3)GABAb B受體可能參與了反復(fù)HBO暴露誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。此外,我們在單次HBO處理結(jié)束3小時后側(cè)腦室注射5-HT1A受體阻斷劑,發(fā)現(xiàn)其對單次HBO處理導(dǎo)致的鎮(zhèn)痛效應(yīng)沒有影響。5-HT1A受體阻斷劑對反復(fù)HBO處理導(dǎo)致的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng)也沒有顯著影響,但在HBO處理結(jié)束7天后側(cè)腦室注射5-HT1A受體阻斷劑,其對反復(fù)HBO處理導(dǎo)致的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)有顯著的抑制作用。這些結(jié)果說明,5-HT1A受體沒有參與單次HBO誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用和反復(fù)HBO誘導(dǎo)的早期鎮(zhèn)痛效應(yīng),但很可能參與了反復(fù)HBO誘導(dǎo)的晚期鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在研究的第四部分,我們利用熒光法觀察中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)中神經(jīng)元的數(shù)量,結(jié)果顯示,反復(fù)HBO處理后的7天后,PAG中的5-HT1A受體陽性神經(jīng)元顯著增加,但在n NOS基因敲除小鼠中,PAG中的5-HT1A受體陽性神經(jīng)元顯著減少,表明n NOS對5-HT1A受體的調(diào)節(jié)作用。在GAD65基因敲除小鼠中,反復(fù)HBO處理后的7天后,PAG中的5-HT1A受體陽性神經(jīng)元顯著減少,表明GAD65對5-HT1A受體的調(diào)節(jié)作用。此外,在PAG中,我們沒有觀察到n NOS+神經(jīng)元和5-HT1A受體陽性神經(jīng)元有重合,但是觀察到n NOS+神經(jīng)元和GAD+神經(jīng)元出現(xiàn)重合,表明n NOS和GAD之間可能直接存在互相作用。最后,Western Blot結(jié)果顯示,反復(fù)HBO處理后的7天后,PAG中5-HT1A受體和GABAB受體的蛋白表達(dá)顯著增高,但在n NOS基因敲除小鼠中,5-HT1A受體和GABAB受體的蛋白表達(dá)都受到了顯著抑制。在GAD65基因敲除小鼠中,5-HT1A受體的蛋白表達(dá)受到了顯著抑制。綜上所述,本研究證明,單次高壓氧導(dǎo)致的急性鎮(zhèn)痛效應(yīng)的機(jī)制涉及到n NOS和GABAA受體的激活,雙相鎮(zhèn)痛效應(yīng)的早期效應(yīng)的機(jī)制涉及到n NOS的激活,而晚期效應(yīng)的機(jī)制涉及到發(fā)生在PAG中的n NOS與GABAB受體的相互作用以及5-HT1A受體的參與。和其他鎮(zhèn)痛藥物方式相比,高壓氧有著不可替代的優(yōu)勢,費用較為低廉,無成癮性、耐受性好,具有巨大的臨床利用價值。本課題證實了高壓氧的短效和長效鎮(zhèn)痛效應(yīng),并從中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制探索其效應(yīng),為高壓氧的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究首次選用HBO-n NOS-GABA-5-HTA1信號傳導(dǎo)系統(tǒng)作為高壓氧鎮(zhèn)痛的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行研究,借此研究可能形成一個完整的思路探索高壓氧的中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制,找出其鎮(zhèn)痛機(jī)制的關(guān)鍵靶點,為開發(fā)鎮(zhèn)痛藥物提供新的策略。

第二部分:氫氣對肺的氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)研究肺的氧化損傷是一種很常見的病理過程。很多因素,如過度吸氧、大氣污染、吸煙、放射、重金屬離子等等都可以造成肺的氧化損傷。需要長期吸氧的病人,一方面需要吸氧,一方面又面臨著肺的氧化損傷的危險。這對矛盾常常難以解決,導(dǎo)致病人最后呼吸衰竭而死。另外,近來研究證明,大氣污染和吸煙使肺組織直接暴露在有害因素中,引起肺臟嚴(yán)重的氧化損傷。放射引起的機(jī)體損傷也主要是氧化損傷,并且60%-70%的損傷是由羥自由基引起的。一些重金屬離子如鎘、鉻和汞等也可以引起肺的氧化損傷。肺的氧化損傷非常常見,因此,如果能找到一種安全、有效的藥物來防治肺的氧化損傷,對人類健康具有重大意義。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,氫氣的應(yīng)用長久以來僅限于呼吸氫氧混合氣進(jìn)行大深度潛水,一般認(rèn)為它不會和體內(nèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。1975年,Malcolm Dole等人首次報道,高壓氫氣(8 ATA)可能可以通過清除羥自由基治療癌癥。2001年,Bouchra Gharib等人發(fā)現(xiàn)高壓氫氣(8 ATA)有對抗寄生蟲引起的肝炎作用,其機(jī)制也和清除羥自由基有關(guān)。但如此高壓的氫氣在臨床上難以應(yīng)用,因此他們的研究并沒有引起廣泛的關(guān)注。直到2007年,Ikuroh Ohsawa等人首次發(fā)現(xiàn),普通壓力的氫氣也能發(fā)揮抗氧化作用,并且其機(jī)制為選擇性清除毒性氧自由基,氫氣的抗氧化作用才得以被廣泛關(guān)注。隨后,有人又證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷、小腸移植引起的炎癥損傷、新生兒腦缺血缺氧損傷等。此外,飲用飽和氫氣水可治療應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷、人類II型糖尿病、化療藥順鉑引起的腎損傷和帕金森病,改善新生兒腦缺血缺氧損傷后神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力等等。這些研究表明,氫氣能夠減輕氧化損傷。肺的氧化損傷的機(jī)理還不是很清楚,但是有很多研究表明它和超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基密切相關(guān)。既然氫氣可以通過選擇性清除氧自由基發(fā)揮抗氧化作用,那么它對肺的氧化損傷有沒有療效呢?我們教研室的前期研究證明氫氣可以減輕高壓氧導(dǎo)致的成年大鼠的肺損傷。但是,高壓氧只是眾多造成肺的氧化損傷的因素的一種,且這種因素并不常見。因此,我們通過構(gòu)建從動物到細(xì)胞的兩種不同的肺的氧化損傷模型,通過不同方式給予氫氣處理,來觀察它對肺的氧化損傷的效應(yīng)。實驗第一部分,我們采用腹腔注射百草枯造成大鼠肺的氧化損傷模型,并通過口服給予大鼠飽和含氫水治療。百草枯進(jìn)入機(jī)體后主要聚集于肺部,經(jīng)過單電子還原形成自由基,然后與分子氧反應(yīng)生成聯(lián)吡啶陽離子和超氧陰離子,后者歧化形成H2O2,再在Fe2+存在下形成羥自由基,引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細(xì)胞膜,使膜受體、膜蛋白酶和離子通道的脂質(zhì)微環(huán)境改變,引起肺組織的氧化損傷。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),口服給予飽和含氫水顯著減少大鼠的胸腔積液、肺濕干比重、支氣管肺泡灌洗液中的蛋白質(zhì)含量和總細(xì)胞計數(shù)、乳酸脫氫酶,以及肺組織中的MDA含量。蘇木精伊紅(H&E)和TUNEL染色顯示氫水組的肺組織損傷和細(xì)胞凋亡顯著減輕。所有這些結(jié)果表明,口服含氫水可以抑制肺的氧化損傷,改善百草枯中毒引起的肺生化和組織學(xué)改變。實驗第二部分,我們用H2O2造成更具代表性的氧化損傷,通過細(xì)胞實驗研究氫氣能否減輕Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的氧化損傷。給予細(xì)胞H2O2處理后,細(xì)胞的死亡率顯著上升,氧化損傷產(chǎn)物MDA和8-OHd G明顯升高,細(xì)胞的抗氧化酶SOD和GSH水平顯著降低,顯示細(xì)胞的抗氧化能力下降。而給予氫氣處理后,氫氣可以有效降低A549細(xì)胞受到氧化損傷后的壞死率,有效抑制A549細(xì)胞氧化損傷后MDA、8-OHd G的升高和SOD、GSH的下降。
所有這些結(jié)果表明,含氫培養(yǎng)基可以提高Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的抗氧化能力,抑制H2O2造成的細(xì)胞氧化損傷。

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