最初,氫氣(Hydrogen gas,H2)被認(rèn)為是生理性惰性氣體。1975年《Science》報(bào)道,高壓H2干預(yù)對(duì)小鼠皮膚癌有明顯改善作用,然而氫氣生物學(xué)效應(yīng)并未引起足夠重視。2007年《Nature Medicine》撰文報(bào)道H2可以作為抗氧化劑改善大鼠腦缺血損傷,從而引起學(xué)術(shù)界的轟動(dòng)。2013年《Plant Cell and Environment》報(bào)道,外源施用H2可以緩解百草枯誘導(dǎo)的紫花苜蓿幼苗氧化損傷。2014年《Plant Physiology》發(fā)文報(bào)道,外源施用H2可以增強(qiáng)擬南芥耐旱性。自此,氫氣生物學(xué)效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究逐漸受到青睞。氫氣生物學(xué)主要包括氫醫(yī)學(xué)和氫農(nóng)學(xué)。與氫農(nóng)學(xué)相對(duì)應(yīng)的實(shí)踐是氫農(nóng)業(yè),氫農(nóng)學(xué)是研究氫農(nóng)業(yè)相關(guān)規(guī)律的學(xué)科。氫農(nóng)業(yè)是綜合應(yīng)用于種植業(yè)、畜牧業(yè)及水產(chǎn)業(yè)的一種新型綠色生態(tài)農(nóng)業(yè),其主要分為大田氫農(nóng)業(yè)、設(shè)施園藝氫農(nóng)業(yè)、家庭氫農(nóng)業(yè)等。氫農(nóng)業(yè)涉及多個(gè)研究領(lǐng)域,本研究從植物耐旱和耐鹽性以及花卉保鮮的機(jī)理研究入手分別以紫花苜蓿、擬南芥以及洋桔梗切花為試驗(yàn)材料;通過(guò)使用藥理學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等手段探究H2提高植物耐旱和耐鹽性以及延長(zhǎng)鮮切花保鮮的分子機(jī)制,旨在為H2在農(nóng)業(yè)上的廣泛運(yùn)用提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究的具體結(jié)果如下:已經(jīng)知道,外源施用H2和一氧化氮(Nitric oxide,NO)均可以提高植物滲透脅迫(模擬干旱)耐性,但尚不清楚H2和NO在增強(qiáng)紫花苜蓿滲透脅迫耐性過(guò)程中是否存在相互作用。在這項(xiàng)研究中,外源施用氫氣(以富氫培養(yǎng)液形式)可以顯著提高紫花苜蓿幼苗NO產(chǎn)生,進(jìn)而提高幼苗滲透脅迫耐性。結(jié)合富氮培養(yǎng)液確定了富氫培養(yǎng)液的作用主要來(lái)源于H2,部分來(lái)源于富氫導(dǎo)致的低氧效應(yīng)。外源施用NO清除劑可以抑制H2緩解滲透脅迫誘導(dǎo)的幼苗生長(zhǎng)抑制,提示NO可能參與了外源H2提高紫花苜蓿幼苗滲透脅迫耐性。外源施用硝酸還原酶(一種NO合成酶)抑制劑(鎢酸鹽)提示,H2誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生主要來(lái)源于硝酸還原酶催化途徑。進(jìn)一步的研究證實(shí),H2分別通過(guò)誘導(dǎo)和降低脯氨酸合成酶和脯氨酸降解酶的活性/基因表達(dá)提高滲透脅迫下苜蓿幼苗脯氨酸含量,進(jìn)而增強(qiáng)幼苗滲透脅迫耐性。組織化學(xué)染色分析幼苗脂質(zhì)過(guò)氧化和質(zhì)膜完整性證實(shí),外源施用H2可以顯著緩解滲透脅迫誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和質(zhì)膜完整性損傷。此外,H2通過(guò)提高滲透脅迫下抗氧化酶活性和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本水平增強(qiáng)紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力。上述結(jié)果提示,H2提高苜蓿滲透脅迫耐性與重建細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)有關(guān)。最后,本研究初步證實(shí)H2的作用還可能部分與依賴于NO的蛋白質(zhì)S-亞硝基化修飾有關(guān)。綜上所述,外源施用H2介導(dǎo)的紫花苜蓿幼苗滲透脅迫耐性與NO誘導(dǎo)的脯氨酸積累與氧化還原穩(wěn)態(tài)重建相關(guān)。研究顯示,外源H2和內(nèi)源褪黑素(Melatonin,MT)均可以提高植物耐鹽性,但內(nèi)源H2是否參與提高植物耐鹽性以及H2與MT在植物響應(yīng)鹽脅迫之間的相互作用尚未報(bào)道。在這項(xiàng)研究,外源施用H2通過(guò)上調(diào)5-羥色胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶(SNAT,MT合成途徑中的關(guān)鍵酶)基因表達(dá)提高M(jìn)T產(chǎn)生,進(jìn)而增強(qiáng)野生型擬南芥耐鹽性。然而,外源施用H2不能降低atsnat(擬南芥SNAT缺失突變體)的鹽敏感性提示,MT可能參與了外源H2提高擬南芥耐鹽性。本研究進(jìn)一步通過(guò)使用CrHYD1轉(zhuǎn)基因擬南芥(過(guò)表達(dá)萊茵衣藻產(chǎn)氫酶基因(CrHYD1),模擬內(nèi)源H2產(chǎn)生)、atsnat/CrHYD1-4雜交株系以及atsnat突變體驗(yàn)證上述結(jié)論。與野生型相比,CrHYD1 轉(zhuǎn)基因株系(CrHYD1-3 和 CrHYD1-4)和 atsnat/CrHYD1-4雜交株系的內(nèi)源氫氣含量較高,且CrHYD1株系的耐鹽性較高。然而,與CrHYD1-4株系相比,atsnat/CrHYD1-4雜交株系的鹽敏感性更高。進(jìn)一步的研究結(jié)果證實(shí),CrHYD1株系中SNAT的mRNA水平和MT含量更高。上述結(jié)果提示,MT作為內(nèi)源H2的下游信號(hào)參與提高擬南芥耐鹽性。鹽脅迫下擬南芥幼苗鈉(Na+)和鉀(K+)含量分析顯示,與野生型相比,CrHYD1株系的Na+/K+更低,而atsnat/CrHYD1-4和atsnat的Na+/K+較高。基因表達(dá)分析顯示,CrHYD1轉(zhuǎn)基因幼苗中離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SOS1、SOS2、SOS3、AKT1和NHX1)表達(dá)量較高,而在atsnat/CrHYD1-4和atsnat中的表達(dá)量較低。非損傷微測(cè)技術(shù)檢測(cè)幼苗根部離子流速證實(shí),與野生型相比,活體狀態(tài)下CrHYD1株系的Na+外排流速較高、H+內(nèi)流流速較高,而K+外排流速較高;而atsnat/CrHYD1-4和atsnat幼苗呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。此外,與野生型相比,CrHYD1株系的過(guò)氧化氫含量和脂質(zhì)過(guò)氧化水平較低、抗氧化酶活性以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本水平較高;相反地,內(nèi)源H2的作用在atsnat/CrHYD1-4中被抑制。綜上所述,內(nèi)源H2通過(guò)上調(diào)SNAT表達(dá)誘導(dǎo)MT積累激活離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和抗氧化酶基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)根部離子轉(zhuǎn)運(yùn)并增強(qiáng)抗氧化能力,維持鹽脅迫下幼苗的氧化還原和離子穩(wěn)態(tài),進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥耐鹽性。綜上所述,依賴于SNAT產(chǎn)生的MT,至少在提高擬南芥耐鹽性方面是內(nèi)源H2的下游信號(hào)分子。
研究證實(shí),外源施用H2可以延長(zhǎng)采后百合和玫瑰鮮切花保鮮;但是,內(nèi)源H2是否以及如何延長(zhǎng)切花保鮮的相關(guān)機(jī)理仍然不清楚。本研究以洋桔梗鮮切花為試驗(yàn)材料,證實(shí)切花衰老期間內(nèi)源氫氣穩(wěn)態(tài)和氧化還原平衡被破壞。氣相色譜法測(cè)定內(nèi)源H2濃度證實(shí),外源施用氫氣(以富氫水形式)可以提高切花內(nèi)源H2水平,但2,6-二氯酚靛酚(DCPIP,內(nèi)源H2合成抑制劑)抑制了內(nèi)源H2產(chǎn)生。切花的瓶插時(shí)間、花徑和鮮重?cái)?shù)據(jù)顯示,與對(duì)照組相比,外源施用H2延長(zhǎng)了洋桔梗鮮切花保鮮,而外源施用DCPIP加速了切花衰老。然而,當(dāng)H2和DCPIP同時(shí)施用時(shí),H2部分抑制了 DCPIP誘導(dǎo)的切花衰老。進(jìn)一步的研究表明,外源施用H2通過(guò)減緩脂質(zhì)過(guò)氧化和增強(qiáng)抗氧化酶活性延長(zhǎng)洋桔梗鮮切花保鮮。此外,與對(duì)照組相比,外源施用H2顯著抑制了可溶性蛋白和葉綠素的降解,同時(shí)提高脯氨酸積累。然而,外源施用DCPIP抑制了 H2的上述作用。綜上所述,H2通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力和脯氨酸合成、抑制可溶性蛋白和葉綠素的降解延長(zhǎng)洋桔梗鮮切花保鮮,進(jìn)而延長(zhǎng)洋桔梗切花保鮮期。本研究分別從氫農(nóng)業(yè)的三個(gè)重要領(lǐng)域展開(kāi)研究,揭示了外源施用H2通過(guò)調(diào)動(dòng)NO信號(hào)參與提高紫花苜蓿幼苗滲透脅迫耐性、褪黑素作為內(nèi)源H2的下游信號(hào)分子增強(qiáng)擬南芥耐鹽性以及內(nèi)源H2延長(zhǎng)洋桔梗鮮切花保鮮期的分子機(jī)制。上述研究結(jié)果不僅促進(jìn)了氫農(nóng)學(xué)相關(guān)分子機(jī)制的研究,而且為H2在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、園藝栽培和家庭中的運(yùn)用提供理論指導(dǎo),同時(shí)為大田氫農(nóng)業(yè)、設(shè)施園藝氫農(nóng)業(yè)和家庭氫農(nóng)業(yè)的發(fā)展打下基礎(chǔ)。
