小白菜(Brassicachinensis L.)是一種重要的并在中國廣泛栽植的葉菜類蔬菜。同時(shí),小白菜具有較強(qiáng)的鎘積累能力。探究小白菜的耐鎘機(jī)制并且應(yīng)用安全有效的手段提高小白菜的耐鎘性及降低小白菜可食部分鎘含量是保障蔬菜農(nóng)產(chǎn)品食品安全的重要措施。近年來,比較不同耐鎘性及鎘積累能力的蔬菜,并探究品種間的差異機(jī)制一直是探索蔬菜耐鎘機(jī)制的研究熱點(diǎn)。并且,以富氫水(hydrogen-richwater,HRW)為主要供給形式,探究H2在植物耐鎘機(jī)制中所起的生物學(xué)功能已成為新的研究熱點(diǎn),但是H2在植物抗鎘過程中所起的分子機(jī)制尚不明確。本文以小白菜為試驗(yàn)材料,初步探究了不同品種小白菜耐鎘性差異的機(jī)制,并且研究了 HRW緩解小白菜鎘脅迫并降低小白菜鎘積累的機(jī)制,取得了以下主要結(jié)果:1.分析了 9個(gè)不同品種小白菜鎘耐性。采用水培的方式,分別比較了不同品種小白菜分別在0、5、10和50 μM CdCl2處理下的生長情況及Cd積累情況。最終篩選出鎘敏感型且高積累小白菜-‘上海青’、耐鎘型且高積累小白菜-‘抗熱605’和耐鎘型且低積累小白菜-‘五月慢’。通過對(duì)鎘含量的比較最終篩選出高鎘積累型小白菜-‘上海青’和‘抗熱605’、低鎘積累型小白菜-‘五月慢’。并且通過非損傷技術(shù)(NMT,Non-invasive micro-test technology)的檢測發(fā)現(xiàn),‘抗熱605’根部Cd2+流速最大,‘五月慢’的根部Cd2+流速最小,.進(jìn)一步表明‘抗熱605’根部鎘吸收能力較強(qiáng),而‘五月慢’根部鎘吸收能力較弱。qRT-PCR結(jié)果顯示,與鎘吸收相關(guān)的BcZIPs家族基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致了‘抗熱605’對(duì)于鎘的吸收能力較高;而‘五月慢’富集鎘能力較弱的原因可能是與鎘吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量較低有關(guān)。除此以外,在相同鎘處理下,BcGSTUs家族基因的表達(dá)量因小白菜品種不同而不同,其中BcGSTUs家族基因在‘抗熱605’中的表達(dá)量較高。為了確定BcGSTUs在小白菜鎘耐性中所起的作用,我們從‘抗熱605’中分離出表達(dá)量較高的BcGSTU4、BcGSTU11、BcGSTU12和BcGSTU22,并轉(zhuǎn)入鎘敏感型酵母突變體中,結(jié)果顯示BcGSTU11具有緩解酵母鎘毒害的作用。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果我們推測:‘抗熱605’具有較高的鎘耐性可能是由于BcGSTUs的表達(dá)較高;由于BcGSTUs家族基因表達(dá)量較低,所以‘上海青’表現(xiàn)出了較低的耐鎘性。2.與單獨(dú)Cd處理相比,HRW能夠明顯緩解Cd對(duì)小白菜產(chǎn)生的生長抑制,并且顯著降低了小白菜地上部和地下部的Cd含量,但是HRW對(duì)小白菜Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)沒有顯著影響。同時(shí),HRW對(duì)Cd脅迫下小白菜地上部和地下部的Fe、Zn含量有顯著的影響。隨后,運(yùn)用高通量測序(RNA-sequencing analysis)技術(shù),從轉(zhuǎn)錄水平上詳細(xì)闡述了 HRW緩解小白菜Cd脅迫并降低小白菜Cd積累的生理機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示HRW能夠顯著影響Cd脅迫下小白菜對(duì)于亞鐵離子的還原性以及對(duì)Zn2+的結(jié)合能力,并且提高了與Cd解毒(GSTUs、GSH-Pxs、Glutaredoxins)相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)合GO和KEGG功能分析的結(jié)果,最終篩選出差異表達(dá)倍數(shù)較高的兩個(gè)編碼金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)體基因:BcIRT1和BcZIP2。隨后利用酵母突變體功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BcIRT1和BcZIP2加劇了酵母對(duì)于各金屬脅迫的敏感性,并提高了酵母對(duì)Cd2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+的積累能力,因此推測BcIRT1和BcZIP2具有轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+的功能。對(duì)BcIRT1和BcZIP2基因表達(dá)譜的分析結(jié)果顯示,隨著處理時(shí)間的逐漸延長,HRW對(duì)BcIRT1和BcZIP2表達(dá)量的抑制作用就越明顯。并且隨著Cd脅迫濃度的逐漸增加,HRW對(duì)BcIRTI和BcZIP2表達(dá)量的抑制作用也越明顯。

綜上所述,這些研究結(jié)果初步闡明了 HRW可能是通過抑制與Cd吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因BcIRT1和BcZIP2的表達(dá)來降低小白菜對(duì)于Cd的吸收。3.離子含量檢測及Cd2+熒光染色結(jié)果表明了,不同Cd濃度處理下,HRW能夠顯著降低小白菜地上部及地下部Cd的積累,并通過NMT進(jìn)一步確定HRW能夠降低小白菜根部對(duì)Cd2+的吸收。同時(shí),熒光定量(qRT-PCR)與半熒光定量(Semi-qPCR)的結(jié)果表明,HRW能夠顯著抑制Cd脅迫下小白菜根部BcIRT1和BcZIP2的表達(dá),該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果相一致。對(duì)BcIRT1和BcZIP2生物信息學(xué)的分析結(jié)果顯示,BcIRT1和BcZIP2分別與AtIRT1和AtZIP2具有很高的同源性,并具有相似的蛋白結(jié)構(gòu),因此我們推測BcIRT1和AtIRT1、BcZIP2和AtZIP2具有相似的功能。隨后構(gòu)建相應(yīng)的擬南芥轉(zhuǎn)化體系,并獲得純合轉(zhuǎn)基因擬南芥。與單獨(dú)Cd處理相比,HRW顯著降低了 WT、回補(bǔ)株系(ComIRT1、ComZIP2)和過表達(dá)株系(OEIRT1、OEZIP2)株系擬南芥中的Cd含量。并通過NMT技術(shù),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HRW能夠降低WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥根部Cd2+流速,而對(duì)irt1和zip2突變體擬南芥根部Cd2+流速?zèng)]有顯著影響。此外,HRW在不同程度上影響了 Cd與Fe以及Cd與Zn之間的離子相互競爭力。綜上所述,HRW降低小白菜和擬南芥Cd含量可能是由于HRW降低了與Cd吸收相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因IRT1和ZIP2的表達(dá)。