有機磷農(nóng)藥（Organophosphate pesticides，OPs）是目前使用最為廣泛的一種化學(xué)合成殺蟲劑，它所引起的毒性作用已成為全球關(guān)注的公共問題。急性O(shè)Ps暴露癥狀明顯、便于救護；長期低劑量是人群接觸OPs的主要方式，可導(dǎo)致多器官損傷，與多種癌癥發(fā)生具有相關(guān)性并可引起中樞神經(jīng)發(fā)育遲緩、學(xué)習(xí)、記憶功能下降等。氫分子一直被認(rèn)為是一種生理惰性氣體，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)它是一種可以選擇清除超氧陰離子的新型抗氧化劑，其對OPs毒性的保護作用及分子機制未見報道。本研究針對OPs毒性作用的分子機制和防護方法進(jìn)行探討。研究發(fā)現(xiàn)，OPs可以引起細(xì)胞和生物體產(chǎn)生活性氧，激活EB病毒并對腦、肝組織形成損傷。氫分子可在活性氧產(chǎn)生階段及時阻斷，進(jìn)而抑制EB病毒激活，緩解腦、肝損傷。這一研究為將氫分子應(yīng)用于OPs長期低劑量接觸危險人群，提供一種簡便易行的日常防護方法奠定了基礎(chǔ)，同時關(guān)于OPs和氫分子作用分子機制的探討具有重要的科學(xué)意義。 本論文的主要研究工作如下： 1.毒死蜱激活EB病毒及氫分子的抑制作用：EB病毒的人群感染率超過90%，病毒的活性狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。低毒類OPs毒死蜱（Chlorpyrifos，CPF）作用于攜帶潛伏期EB病毒Raji細(xì)胞4h，檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和EB病毒立早期基因BZLF-1表達(dá)。熒光探針CM-H2DCFDA檢測發(fā)現(xiàn)CPF誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）累積，非酶類抗氧劑GSH含量顯著性減低。低濃度CPF引起Raji細(xì)胞抗氧化酶SOD、CAT活性升高，高濃度則造成這兩個酶活性降低，說明CPF可以誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。CPF造成Raji細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著性升高，DNA斷裂水平明顯增加；Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)EB病毒立早期基因BZLF-1表達(dá)上調(diào)。氫分子可以改善細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，保護生物大分子損傷，并且抑制EB病毒BZLF-1表達(dá)上調(diào)，說明氫分子緩解Raji細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，抑制EB病毒激活。

以上結(jié)果說明有機磷農(nóng)藥可能與EB病毒具有協(xié)同致癌作用，氫分子可以在ROS誘發(fā)階段阻斷EB病毒的激活和生物大分子損傷，對有機磷農(nóng)藥日常防護有重要意義。 2.毒死蜱降低乙酰膽堿酯酶（AChE）活性及氫分子的保護作用。8周齡健康Wistar大鼠每天以1/20LD50毒死蜱灌胃8周建立模型亞毒劑量染毒模型，通過飲用氫水方式補給氫分子。CPF經(jīng)過細(xì)胞色素P450酶CYP2B6亞型的催化轉(zhuǎn)化為毒性很高的CPO，后者可以被對氧磷酶1（PON1）轉(zhuǎn)化成毒性較小的3，5，6-三氯-2-吡啶酚（3,5,6-trichloropyridine-2-phenol，TCP）進(jìn)行解毒，或者與AChE不可逆的共價結(jié)合，使AChE喪失活性，造成乙酰膽堿在作用位點累積從而引發(fā)各種中毒癥狀。實驗結(jié)果表明，CPF重復(fù)染毒造成血清和腦組織AChE活性顯著降低，與正常對照組相比分別下降了20.05%和63.48%。氫分子緩解CPF染毒造成的AChE活性降低，提示氫分子除了具有已知的清除羥自由基的功能外，還可能直接作用于有機磷農(nóng)藥的活性代謝產(chǎn)物CPO，這一研究為進(jìn)一步深入研究氫分子的生物學(xué)效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)，拓展了氫分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。 3.毒死蜱引起腦、肝組織損傷及氫分子的保護作用：亞毒劑量CPF引起機體、腦和肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為血清MDA含量升高，SOD和CAT酶活性降低。腦組織MDA含量、SOD活性、CAT活性升高；肝臟MDA含量、SOD活性升高，然而CAT水平降低。海馬是腦中與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的神經(jīng)元，浦肯野細(xì)胞層是與運動協(xié)調(diào)相關(guān)的神經(jīng)元，CPF染毒造成海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和浦肯野細(xì)胞層神經(jīng)元胞體減小，胞核皺縮等，說明神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷；肝臟出現(xiàn)水腫，未見壞死、炎癥等損傷；TUNEL染色顯示腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，而肝臟中未見凋亡細(xì)胞，以上實驗結(jié)果說明CPF染毒造成腦組織的損傷高于肝臟。氫分子緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)、保護神經(jīng)元、肝細(xì)胞損傷。MnSOD定位于線粒體中，過量表達(dá)具有抗凋亡的作用，肝組織中MnSOD顯著表達(dá)上調(diào)，腦組織中則MnSOD沒有明顯升高，同時腦組織中缺乏CPO解毒酶PON1，使得CPF以毒性很高的CPO形式存在。肝臟由于MnSOD高表達(dá)和代謝解毒酶PON1的作用損傷程度較輕。氫分子對損傷有明顯的保護作用。 4.毒死蜱引起肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)基因變化及氫分子的作用。氧化應(yīng)激信號通路包括ROS代謝相關(guān)基因，抗氧化相關(guān)基因、氧轉(zhuǎn)運蛋白和其他氧化應(yīng)激相關(guān)基因。PCR芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CPF染毒造成Fmo2、Sod2、Cygb、Ldha、Gpx、Nox4、Gclc、Gclm、Cat等基因變化。氫分子改善了這些變化。 綜上所述，有機磷農(nóng)藥可以引起細(xì)胞和生物體產(chǎn)生活性氧，激活EB病毒并對腦、肝組織形成損傷。氫分子可在活性氧產(chǎn)生階段阻斷，抑制EB病毒激活，緩解腦、肝損傷。氫分子作為有機磷農(nóng)藥長期低劑量接觸危險人群的日常防護措施奠定了一定的基礎(chǔ)。