作者：東方肝膽外科醫(yī)院博士研究生李東宇，導(dǎo)師楊廣順教授
 

對于原發(fā)性肝癌及肝轉(zhuǎn)移瘤患者來說，肝切除術(shù)是經(jīng)典且有效的改善手段，可以顯著改善患者的預(yù)后，但同時(shí)也為患者帶來了圍手術(shù)期風(fēng)險(xiǎn)。相對于局部肝切除術(shù)而言，行擴(kuò)大肝切除術(shù)的患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病率和死亡率均較高，而有慢性肝病的患者手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)更高。但是，隨著對肝臟解剖認(rèn)識的不斷加深、外科技術(shù)的進(jìn)步和圍手術(shù)期監(jiān)護(hù)水平的提高，擴(kuò)大肝切除的手術(shù)指征在拓展，并且也取得了一定的效果。盡管如此，行擴(kuò)大肝切除術(shù)后仍不可避免的會出現(xiàn)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，肝功能衰竭就是其中之一，其死亡率高達(dá)70-80%。擴(kuò)大肝切除術(shù)對肝功能的損傷包括了物理損失和缺血再灌注損傷，如何對接受擴(kuò)大肝切除術(shù)的患者進(jìn)行有效的肝功能保護(hù)是臨床上比較重視和關(guān)心的問題。
 

針對缺血再灌注損傷機(jī)制，目前研究證實(shí)有保護(hù)作用的藥物主要分為：自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、炎性細(xì)胞因子抑制劑、微循環(huán)改善藥物等。近年來，氫氣抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用逐漸被廣大學(xué)者所重視，大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，氫氣可以通過對抗氧自由基，減輕ROS系統(tǒng)對細(xì)胞的損傷，減少細(xì)胞凋亡，從而有效地保護(hù)細(xì)胞，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。本課題中，我們將首先建立豬70%擴(kuò)大肝切除模型，并評價(jià)其安全性及臨床模擬性;然后將在確認(rèn)氫生理鹽水對豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝臟功能的保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，通過測定幾種炎性細(xì)胞因子水平、幾種凋亡相關(guān)蛋白活性及轉(zhuǎn)錄因子水平等，以進(jìn)一步探討氫生理鹽水在對豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用方面亞細(xì)胞水平及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制。
 

第一部分、豬70%擴(kuò)大肝切除模型的建立
 

目的：建立豬70%擴(kuò)大肝切除模型，并評估其安全性及臨床模擬性。
 

材料和方法：6只巴馬小型豬，體重在25.30kg，在全麻條件下行70%肝臟切除術(shù)，術(shù)中給予全肝門阻斷。監(jiān)測術(shù)中生命體征情況，記錄術(shù)后7天存活率，檢測術(shù)前及術(shù)后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALE、AST)及血紅蛋白(HGB)變化。
 

結(jié)果：術(shù)中生命體征平穩(wěn)，術(shù)后7天存活率100%，無嚴(yán)重并發(fā)癥。術(shù)后TBIL顯著升高(P<0.05)，術(shù)后第3天到達(dá)峰值，之后逐步恢復(fù)。ALT，AST在術(shù)后5日內(nèi)升高顯著(P<0.05)，術(shù)后第1日達(dá)到峰值，之后逐步恢復(fù)。監(jiān)測血常規(guī)HGB未見明顯貧血改變。
 

結(jié)論：豬70%擴(kuò)大肝切除模型安全穩(wěn)定，具有較好的臨床模擬性，可用于擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝損傷的研究。
 

第二部分、氫生理鹽水對豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用及機(jī)制研究。
 

目的：研究氫生理鹽水對豬擴(kuò)大肝切除術(shù)后肝功能的保護(hù)作用，并從抗氧化、抗炎、
 

抗凋亡及肝再生等方面探討其相關(guān)機(jī)制。一
 

材料和方法：12只巴馬小型豬，體重在25.30蠔，隨機(jī)分為70%肝切除+生理鹽水對照組(Ns組，n=6)和70%肝切除+氫生理鹽水實(shí)驗(yàn)組(H2組，n=6)，均在全麻條件下行70%肝臟切除術(shù)。氫生理鹽水干預(yù)方案：行擴(kuò)大肝切除術(shù)，并給予全肝門阻斷。解除肝門阻斷后即經(jīng)胃網(wǎng)膜右靜脈置管，給予氫生理鹽水250ml靜滴，之后術(shù)后第1、2、3d均經(jīng)胃網(wǎng)膜右靜脈給予氫生理鹽水250ml。NS組以等量生理鹽水作為對照。觀察兩組的7d生存率，術(shù)前及術(shù)后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALT，AST)及血常規(guī)(WBC、HGB)變化。術(shù)后第7d處死動物，觀察其肝臟病理改變(光鏡及電鏡)，用相應(yīng)的檢測試劑盒分別測定肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)含量。用ELISA法檢測IL.6、TNF.a、IL.1 13等炎性因子的血清水平，用Real—timePCR法檢測肝組織中炎癥信號相關(guān)分子P65的mRNA水平的變化。免疫組化p65染色觀察肝組織炎性改變，ki67染色觀察肝細(xì)胞增殖情況。用Western Blot法測定BCL-2、PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，用Western Blot法測定p65、IKBa、IKK Q、IKK 13等分子的表達(dá)水平。
 

結(jié)果：

1、7d生存率：兩組在體重、手術(shù)時(shí)間、肝門阻斷時(shí)間、麻醉時(shí)間、術(shù)中失血量等方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的7d生存率均為100%。

2、肝功能及血常規(guī)變化：與NS組相比，H2組TBIL術(shù)后第1至7d均顯著下降，TBIL同樣在術(shù)后第3d達(dá)到峰值，但峰值顯著下降;與Ns組相比，H2組ALT，AST在術(shù)后第1至7d均顯著下降，同樣在術(shù)后第1日達(dá)到峰值，但峰值顯著下降。

3、光鏡下病理改變：NS組術(shù)后7d可見肝細(xì)胞變性并伴有炎性細(xì)胞浸潤，肝竇內(nèi)皮剝脫、肝竇結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)門靜脈內(nèi)皮損傷等均較明顯：與NS組相比，H2組術(shù)后7d肝細(xì)胞腫脹、變性較輕，門管區(qū)靜脈內(nèi)皮損傷不明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)無明顯紊亂。

4、電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變：NS組術(shù)后7d可見細(xì)胞核固縮反應(yīng)，并可見凋亡小體形成，線粒體出現(xiàn)空泡，線粒體膜擴(kuò)張、嵴消失，胞漿內(nèi)空泡形成，。與NS組相比，H2組術(shù)后7d細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，未見明顯染色質(zhì)聚集，線粒體改變不明顯，未見明顯凋亡小體：

5、肝組織氧化應(yīng)激的檢測：與Ns組相比，H2術(shù)后可見組織MDA含量明顯降低，SOD及CAT含量明顯升高。

6、血清中IL-6、TNF-a、IL.1 13等炎性因子的變化：與NS組相比，H2組IL.6、TNFa、IL.1 13表達(dá)水平明顯降低(P<O.05)。

7、免疫組化染色：p65染色顯示，與Ns組相比，H2組術(shù)后7天p65胞漿著色減弱，提示炎性反應(yīng)可能減輕。ki67染色顯示，與Ns組相比，H2組術(shù)后7天ki67染色陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，提示肝細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)。

8、肝組織中p65分子mRNA水平的變化：與Ns組相比，H2組p65分子mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<O.05)。

9、BCL.2、Cleaved PARP等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：與Ns組相比，H2組肝組織中Bcl.2抑凋亡蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Cleaved PARP的表達(dá)水平降低。

10、肝組織p65、IKB Q、IKK Q、IKK 13等炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)水平：與Ns組相比，H2組p65表達(dá)明顯減少，而IKB Q的表達(dá)明顯增加。IKK Q、IKK13的表達(dá)水平無明顯變化。
 

結(jié)論：

l、氫生理鹽水可有效減輕擴(kuò)大肝切除術(shù)后的肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖;

2、氫生理鹽水可以減輕缺血再灌注時(shí)氧自由基對組織的損傷;

3、氫生理鹽水通過抑制NF.KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制了炎癥因子的表達(dá)，減輕了肝臟組織的炎癥反應(yīng);

4、氫生理鹽水可有效抑制細(xì)胞凋亡。
 

東方肝膽外科醫(yī)院從事氫氣醫(yī)學(xué)效應(yīng)研究的課題組包括吳老、王紅陽院士關(guān)于肝硬化保護(hù)，俞偉峰主任關(guān)于氫氣對抗疼痛，楊廣順教授關(guān)于肝臟手術(shù)損傷保護(hù)，周偉平教授關(guān)于膽管淤積肝硬化。上述研究氫思語都先后進(jìn)行了介紹。今天介紹的是楊教授課題組關(guān)于肝臟大部分切除后肝臟保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究。
 

楊廣順院長介紹

楊廣順，男，1952年1月出生，安徽人，1988年畢業(yè)于第二軍醫(yī)大學(xué)肝膽外科專業(yè)，獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，曾于2000年赴約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)修?，F(xiàn)任東方肝膽外科教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，膽道二科主任，兼任全軍肝膽外科專業(yè)委員會主任委員、上海市普外學(xué)會副主任委員等多個(gè)學(xué)術(shù)任職。楊廣順教授擅長肝膽腫瘤的診治和肝移植?？蒲兄鞴シ较颍涸l(fā)性肝癌的臨床診治，原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)機(jī)制研究，肝移植的基礎(chǔ)與臨床研究。曾承擔(dān)上海市發(fā)展基金重大課題《肝癌的標(biāo)準(zhǔn)化改善方案研究》和國家自然科學(xué)基金等4項(xiàng)課題，發(fā)表論文62篇，參編專著12部。先后獲上海市醫(yī)學(xué)科技一等獎、軍隊(duì)醫(yī)療成果二等獎、上海市科技進(jìn)步二等獎等6項(xiàng)獎勵。于1996年入圍上海衛(wèi)生系統(tǒng)首批“百人計(jì)劃”，楊廣順2012年榮獲“中國名醫(yī)百強(qiáng)榜”上榜名醫(yī)。