桂林醫(yī)學(xué)院研究生畢業(yè)論文，導(dǎo)師林高翔
隨著近年來臨床手術(shù)中冠脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)等微創(chuàng)手術(shù)的發(fā)展,術(shù)后早期并發(fā)癥的防治成為時下研究的熱點,而其中最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥一心肌缺血再灌注損傷越來越受到人們的關(guān)注。糖尿病是一種臨床常見的慢性疾病, 流行病學(xué)和臨床研究顯示,糖尿病人群中缺血性心臟病的發(fā)生率及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)高于非糖尿病人群。目前,人們將更多得將目光放在糖尿病對心肌缺血再灌注損傷的影響上。近年來大量研究表明,氫氣是一種重要的生理性調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞和器官水平上,具有明確的選擇性抗氧化、抗炎癥和抗細(xì)胞凋亡等臟器保護(hù)作用,本研究復(fù)制糖尿病大鼠模型,觀察氫氣腹腔注射對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為糖尿病患者圍術(shù)期處理提供理論依據(jù)。
第一部分氫氣對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響。
目的:觀察氫氣對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法:以鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病模型,造模成功后繼續(xù)高糖喂養(yǎng)4周作心肌I/R損傷模型。60只成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量300—350 克,隨機數(shù)字表法分非糖尿病假手術(shù)對照組(NS),非糖尿病I/I己組(NI瓜), 非糖尿病氫氣改善組(NH),糖尿病假手術(shù)對照組(DS),糖尿病I/R組(DI/R),糖尿病氫氣改善組(DH),每組10只。假手術(shù)組只穿線包繞冠狀動脈左前降支不接扎,I/R組結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后松開行再灌注 120min制備心肌I/R損傷模型。氫氣改善組于再灌注同時腹腔注射99.6%濃度5ml/kg的氫氣。再灌注120min后,采集動脈血利用分光光度計法測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)活性,同時采用免疫組化法測定各組心肌細(xì)胞Bcl一2、Bax、Caspase3表達(dá)水平。原位末端標(biāo)記 (n肥L)法檢測心肌凋亡細(xì)胞并計算凋亡指數(shù)。結(jié)果:糖尿病大鼠心肌 I/R后血漿LDH、CK—MB水平明顯高于非糖尿病大鼠(P<o.01),同時Bcl.2、 Bax、Caspase3蛋白的表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯增高(P<0.01),與I/R 組相比,氫氣改善各組血漿LDH、CK-MB和凋亡細(xì)胞指數(shù)水平明顯降低, Bcl.2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.01),Bax、Caspase3蛋白陽性細(xì)胞百分率及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯降低(P<o.01)。結(jié)論:氫氣腹腔注射對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl一2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax、Caspase.3蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
I/R組結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后松開行再灌注 120min制備心肌I/R損傷模型。氫氣改善組于再灌注同時腹腔注射99.6%濃度5ml/kg的氫氣。再灌注120min后,采集動脈血利用分光光度計法測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)活性,同時采用免疫組化法測定各組心肌細(xì)胞Bcl一2、Bax、Caspase3表達(dá)水平。原位末端標(biāo)記 (n肥L)法檢測心肌凋亡細(xì)胞并計算凋亡指數(shù)。結(jié)果:糖尿病大鼠心肌I/R后血漿LDH、CK—MB水平明顯高于非糖尿病大鼠(P<o.01),同時Bcl.2、Bax、Caspase3蛋白的表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯增高(P<0.01),與I/R 組相比,氫氣改善各組血漿LDH、CK-MB和凋亡細(xì)胞指數(shù)水平明顯降低, Bcl.2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.01),Bax、Caspase3蛋白陽性細(xì)胞百分率及凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯降低(P<o.01)。結(jié)論:氫氣腹腔注射對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能通過上調(diào)Bcl一2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax、Caspase.3蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
第二部分PI 3K/Akt信號通路在氫氣抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡中的作用。
目的:研究P13K/Akt信號通路與氫氣抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法:以鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病模型,造模成功后繼續(xù)高糖喂養(yǎng)4周作心肌I/I瀕傷模型。50只SD大鼠進(jìn)行糖尿病造模,造模成功40只,再根據(jù)“隨機數(shù)字表法”分成4組,分別為糖尿病假手術(shù)組(DS 組)、糖尿病心肌缺血再灌注組(DI組)、糖尿病心肌缺血再灌注氫氣改善組(DH組)、糖尿病心肌缺血再灌注氫氣改善+LY294002組(DI+LY294002組),每組各10只。采用結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支建造大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，再灌注時給予腹腔注射氫氣，LY294002于注射氫氣前經(jīng)鼠尾靜脈注入。免疫組化技術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞Bad表達(dá)水平,反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)檢測心肌細(xì)胞pAkt mRNA表達(dá)。結(jié)果:與DS組比較,DI/R組、DH組、DH+LY294002組的心肌組織Bad蛋白水平均升高(P<0.01);與DI/R組相比較,DH組心肌組織Bad蛋白水平降低 (P<0.01),而DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平差異無顯著性 (P>0.05);與DH組相比較,DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平升高(P<O.01)。與DS組比較,DI/R組、DH組、DH+LY294002組心肌組織pAktmRNA 表達(dá)水平均增高(P<0.01);與DI/R組相比較,DH組心肌組織pAktmRNA 表達(dá)水平增高(P<0.01),而DH+LY294002組心肌組織Bad蛋白水平差異無顯著性(P>0.05);與DH組相比較,DH+LY294002組心肌組織pAktmRNA 表達(dá)水平降低(P<o.01)。結(jié)論:氫氣有效抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的機制可能是通過激活P13K/Akt信號通路而實現(xiàn)的。
