這是一項(xiàng)是關(guān)于氚標(biāo)記方法示蹤哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝氫氣的研究，1953年發(fā)表在ARCH BIOCHEM ANDBIOPHYS，論文作者Grant N. Smith(格蘭特·史密斯)等來自美國通用電氣公司放射生物學(xué)部。
 

Smith G N , Emerson R J , Temple L A , et al. The oxidation of molecular tritium in mammals[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1953, 46(1):22-30.
 

氫氣生物學(xué)效應(yīng)研究，今天已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。但氫氣在動(dòng)物和人體內(nèi)的代謝仍然存在疑問，這非常不利于對(duì)氫氣生物學(xué)效應(yīng)的全面理解。這一沉寂的歷史文獻(xiàn)，從放射性標(biāo)記角度，給出了關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞代謝氫氣的重要線索，非常值得重視。由于這一研究提供了氫氣在大鼠這種高等動(dòng)物體內(nèi)代謝的重要線索，應(yīng)該成為氫氣生物醫(yī)學(xué)的最經(jīng)典支持文獻(xiàn)。所有氫生物醫(yī)學(xué)研究者都應(yīng)該認(rèn)真閱讀學(xué)習(xí)。
 

該研究小組曾經(jīng)用氚標(biāo)記氫氣研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入身體內(nèi)的氫氣能被腸道和土壤內(nèi)常見細(xì)菌氧化為水進(jìn)入有機(jī)體。研究有助于理解氚進(jìn)入環(huán)境的途徑，也說明氚標(biāo)記研究微量氫氣在生物體系代謝的可行性。氫氣參與生物氫化反應(yīng)，但受檢測技術(shù)限制，濃度必需在較高情況下才能分析(50年代的檢測水平)。但比較明確的是，氫氣是某些酶催化反應(yīng)的特異性抑制劑(見1950年Stephenson Marjory主編Bacterial metabolism第三版)。因?yàn)橛性S多因素不支持氫氣直接參與生化反應(yīng)過程，因此需要對(duì)氚的生化過程進(jìn)行確定性研究。氚標(biāo)記技術(shù)給氫氣的痕量分析提供了研究可行性。
 

這一研究是用痕量氚氣分析方法研究氫氣能否在哺乳動(dòng)物體內(nèi)被氧化固定。由于腸道內(nèi)細(xì)菌是動(dòng)物體內(nèi)氫氣代謝的重要因素，所以腸道組織作為被觀察目標(biāo)之一。研究有三方面內(nèi)容，1)腸道細(xì)菌代謝氫氣的作用。從腸道內(nèi)分離出細(xì)菌，觀察對(duì)氚氣氧化的作用。2)組織勻漿對(duì)氫氣的氧化作用。各種哺乳動(dòng)物組織勻漿對(duì)氚氣的氧化作用。3)整體動(dòng)物研究不同組織對(duì)氫氣的氧化作用。把動(dòng)物暴露在氚氣環(huán)境下，分析不同組織氚標(biāo)記量，確定組織對(duì)氚氣的固定作用。
 

研究方法
 

本研究氚暴露四種情況：腸道細(xì)菌暴露，大鼠組織暴露，肺呼吸含氚氣體暴露，整體動(dòng)物含氚氣體暴露。后面是具體方法，僅供專業(yè)人員閱讀。
 

細(xì)菌從腸道內(nèi)分離，采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)程序確定類型。制備細(xì)菌懸液，暴露在氚氣條件下，分析氚標(biāo)記活性。
 

哺乳動(dòng)物組織勻漿用0.1M磷酸緩沖液pH7.5稀釋為5%。在無菌條件下采集組織，在制備勻漿和氚暴露過程都持續(xù)保持無菌條件。暴露最后所有勻漿都進(jìn)行細(xì)菌污染的檢測。只有細(xì)菌檢測陰性的組織勻漿才符合要求。動(dòng)物組織勻漿的暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)施和細(xì)菌暴露實(shí)驗(yàn)類似。經(jīng)過暴露后，組織用干燥箱60°C真空干燥24小時(shí)。干燥樣品進(jìn)行燃燒，分析干燥蒸發(fā)的水內(nèi)氚活性。其他部分在10度條件下真空蒸發(fā)，采集水分進(jìn)行放射性分析。
 

整體動(dòng)物氚固定比例研究使用大鼠，將動(dòng)物暴露在含有氚氣的裝置內(nèi)(圖1是吸入和圖2是整體暴露)。

圖1 通過呼吸暴露氚氣裝置。
 

該裝置整體為閉合系統(tǒng)，含有5個(gè)部分。分別為氚泵(A)、干燥管(B1，B2和B3)，有連續(xù)記錄裝置的電離艙(C, D, E)，一個(gè)雙向閥連接的氣管插管(G和H)、一個(gè)二氧化碳吸收艙(I)和氧氣注入口(J)。(不理解的是，氚泵的工作原理，如何保持氧氣進(jìn)入系統(tǒng)內(nèi)。)
 

氚泵的設(shè)計(jì)是下部瓶內(nèi)氚用上部瓶內(nèi)水進(jìn)行替換，水下流進(jìn)入下瓶，氚氣進(jìn)入上瓶。當(dāng)上部瓶水全部流下，進(jìn)行上下轉(zhuǎn)換，重復(fù)上一程序。氣體在B1干燥管干燥，干燥劑為高氯酸鎂。(無水高氯酸鎂，呈白色多孔顆粒，具有強(qiáng)烈的吸水性，是碳、硫、氫、氧、氮等氣體分析儀器的理想干燥劑。)
 

干燥后的氣體經(jīng)過電離艙(C)耦合微微安培計(jì)(D)和Esterline-Angus圖表記錄器(E)。隨后進(jìn)入另外一個(gè)干燥管(B2)和雙向閥(G)，這一裝置能讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安需吸入管路內(nèi)氣體。壓力計(jì)(F1和F2)在雙向閥兩側(cè)，能觀察氣壓在動(dòng)物呼吸過程中的波動(dòng)。動(dòng)物呼出的氣體經(jīng)過干燥管(B3)和二氧化碳吸收艙(I)凈化。從注氧空(J)注射氧氣補(bǔ)充因二氧化碳吸收導(dǎo)致的氣體缺口，經(jīng)過管路輸入氣體艙的上部瓶內(nèi)(A)。
 

動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉后氣管插管。用上述裝置經(jīng)過完全氚氣暴露后，處死動(dòng)物用絞肉機(jī)把動(dòng)物絞碎，組織放在250毫升25% KOH溶液搖晃4小時(shí)，這個(gè)過程收集釋放出的氣體經(jīng)過微燃燒裝置，燃燒后的水分析氚含量計(jì)算溶解在組織內(nèi)的氚氣。進(jìn)入燃燒裝置前，氣體先通過一個(gè)干冰把氚水冷凝。
 

0.5%氫氣和99.5%氧氣混合氣用于攜帶氚氣進(jìn)入燃燒裝置，KOH消化組織內(nèi)氚代表身體水和有機(jī)物內(nèi)氚化合物含量。
 

動(dòng)物整體暴露裝置也是一個(gè)密閉系統(tǒng)，其中經(jīng)過動(dòng)物呼吸過的氣體進(jìn)行持續(xù)循環(huán)凈化，氚氣水平和氣壓維持穩(wěn)定(圖2)。
 

氚氣從采樣球(A)進(jìn)入系統(tǒng)(B)。經(jīng)過樣本管的氣體經(jīng)過干冰脫水(C)脫水銀蒸汽。氣體通過氣密循環(huán)泵(D)輸入到電離艙，這里有Beckman微微安培計(jì)和Esterline-Angus表記錄儀(我理解類似打印機(jī))。這個(gè)組件能測定循環(huán)系統(tǒng)中氚的水平。此后氣體經(jīng)過另一個(gè)干冰除水裝置(C)，氣體進(jìn)入暴露艙前進(jìn)行壓力測定。
 

暴露艙是一個(gè)璐彩特(聚甲基丙烯酸甲酯)盒，完全浸在在25°C恒溫水中。排除氣體通入二氧化碳吸收管，經(jīng)過飽和氫氧化鉀棉球清除動(dòng)物呼吸產(chǎn)生的二氧化碳，然后氣體通過兩個(gè)高氯酸鎂干燥艙干燥處理，通過給系統(tǒng)補(bǔ)充氧氣和氚氣，維持穩(wěn)定的氣壓和氚含量，泵系統(tǒng)足夠在幾分鐘內(nèi)完成氣體完全循環(huán)。
 

暴露結(jié)束后用空氣沖洗系統(tǒng)大約20分鐘。此時(shí)氚分析顯示沒有氚氣存在于系統(tǒng)內(nèi)。將動(dòng)物取出后處死。動(dòng)物組織勻漿后用Bidwell-Sterling進(jìn)行苯蒸餾。蒸餾后成分用真空干燥去除苯和水分。樣本進(jìn)行焚燒，產(chǎn)生的水進(jìn)行氚含量分析代表有機(jī)物結(jié)合氚。苯蒸餾出的水和石油混合去除苯，水層離心分離后測定氚，代表身體中水的氚含量。

圖2 整體動(dòng)物氚氣暴露艙。
 

研究結(jié)果
 

腸道細(xì)菌固定氚氣為氧化氚(水)的能力很強(qiáng)，這和過去研究結(jié)果一致，說明研究方法穩(wěn)定性好。研究中發(fā)現(xiàn)乳酸糞鏈球菌Streptococcus faecalis氧化氫氣的能力很強(qiáng)，這也是著名的腸道有益菌。
 

(放射性活度是指放射性元素或同位素每秒衰變的原子數(shù)，目前放射性活度的國際單位為貝克勒(Bq)，也就是每秒有一個(gè)原子衰變。放射性活度的國際單位制單位是貝可勒爾(Bq)，常用單位是居里(Ci)。1Ci=37GBq)
 

這里研究發(fā)現(xiàn)氚被氧化固定比例低于1%，各種組織勻漿氧化固定氚的比例見。
 

表1 不同組織勻漿固定氚的能力。(重點(diǎn))
 

顯然大場組織由于存在細(xì)菌，代謝能力超強(qiáng)。其他組織一般都沒有氧化氚的能力，但是脾臟的氧化固定能力非常強(qiáng)，達(dá)到了大腸的6%左右。經(jīng)典的觀點(diǎn)認(rèn)為哺乳動(dòng)物組織并沒有代謝氫氣的作用，這樣高比例的代謝必須引起我們足夠的關(guān)注。小腸、腎臟和肌肉也有相對(duì)強(qiáng)的代謝能力，而脂肪、大腦和肝臟等作用幾乎可以忽略不計(jì)了。這個(gè)研究再次證明，大腸內(nèi)細(xì)菌是代謝利用氫氣的最主要部位。
 

表2.消化道切除對(duì)氚標(biāo)記的影響。
 

為了進(jìn)一步驗(yàn)證大腸細(xì)菌是固定利用氫氣最重要部位的假說。研究進(jìn)一步采樣整體動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過氣管插管給動(dòng)物吸入含氚氣空氣，有正常動(dòng)物，也有切除胃腸道的動(dòng)物(厲害!)，研究結(jié)果見表2. 全身暴露和肺呼吸暴露的無明顯差別，預(yù)先3天口服抗生素會(huì)產(chǎn)生明顯影響(表3)。
 

討論
 

過去研究發(fā)現(xiàn)，含有氫化酶的細(xì)菌能氧化環(huán)境中痕量氚氣分子為氧化氚(氚水)。由于氚濃度非常低，放射劑量比較小，放射損傷不足以影響細(xì)菌的正常代謝。氚濃度是最重要的反應(yīng)速度影響因素。因?yàn)榉派湫詸z測敏感性高，這些研究能用氚測定能研究其變化，但同樣變化的氫氣和氘氣因?yàn)闄z測信號(hào)敏感度因素而無法檢測氘。
 

正常情況下大鼠腸道內(nèi)細(xì)菌具有氧化氚氣的能力，這一研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)不同種群的細(xì)菌氧化氚氣的能力有較大差異。研究結(jié)果在表1中。這一結(jié)果也說明，腸道細(xì)菌是氧化氚的主要因素。在脾臟內(nèi)出現(xiàn)比較大的氧化代謝，這無法用細(xì)菌代謝來解釋，也無法給出合理的解釋。雖然許多動(dòng)物組織在制備過程會(huì)受到細(xì)菌污染，在比較短時(shí)間細(xì)菌可以大量繁殖。本研究似乎難以用細(xì)菌污染來解釋，例如大腸桿菌和普通變形桿菌是最常見的腸道微生物，但假單胞菌是脾臟組織中常見的污染菌。更重要的是，脾臟組織勻漿中細(xì)菌的數(shù)量很少，也不足以影響氚的氧化固定。一般情況下，動(dòng)物組織勻漿中細(xì)菌無法檢測到，氚固定也非常低。這些結(jié)果都有可能受到氫氚物理交換反應(yīng)的影響。
 

整體動(dòng)物插管吸入氚氣的結(jié)果見表2。腸道切除手術(shù)對(duì)氚保留的顯著影響再次證明動(dòng)物腸道細(xì)菌是固定氚的主要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在明顯的個(gè)體差異，原因可能是本研究沒有選擇在品種、體重和年齡完全一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這些動(dòng)物的腸道菌群存在比較大的差別(那個(gè)時(shí)候的實(shí)驗(yàn)要求和現(xiàn)在很不一樣?)。但是消化道切除手術(shù)的動(dòng)物仍然都出現(xiàn)了一致的改變。這更符合腸道菌群是動(dòng)物氧化固定氚氣的主要因素這個(gè)假設(shè)。
 

切除胃腸道的動(dòng)物，大腸內(nèi)細(xì)菌顯然也會(huì)被去除。關(guān)于腸道菌固定氚的推論也有更進(jìn)一步的證據(jù)見表3。
 

表3 抗生素對(duì)動(dòng)物固定氚能力的影響。
 

采用抗生素處理可影響腸道菌的增殖和代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露氚氣前用抗生素處理，能顯著抑制氚固定數(shù)量，這從另一個(gè)方面證明腸道菌群在氚固定中的重要地位。
 

但是細(xì)菌數(shù)量的下降和氚固定的改變沒有明顯的相關(guān)關(guān)系，使用抗生素可將動(dòng)物大便中細(xì)菌數(shù)量降低到正常值的1%，但氚固定減少的比例只有50%左右。數(shù)量和種類都是影響氚固定的重要因素，所以單純細(xì)菌計(jì)數(shù)不能直接反應(yīng)能固定氚的細(xì)菌類型。
 

本研究雖然證明腸道菌是代謝氫氣的重要因素，但是并不能否定哺乳動(dòng)物細(xì)胞本身能代謝氫氣，尤其是發(fā)現(xiàn)抗生素處理大幅度抑制細(xì)菌后氚標(biāo)記仍然保留50%。腸道切除后仍然存在有3%的氚標(biāo)記存在。更直接的研究證據(jù)是發(fā)現(xiàn)脾臟能大量氧化固定氚氣，而小腸組織，腎臟，心臟、肌肉和大腦也具有比較強(qiáng)的固定能力。顯著超過肝臟、胃、皮膚和脂肪固定氚的能力。