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氫氣治療骨關(guān)節(jié)炎，細(xì)胞凋亡和炎癥信號通路研究

文章來源：admin發(fā)布日期：2021-06-04 16:31瀏覽次數(shù)：
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論文作者來自海南醫(yī)學(xué)院和溫州醫(yī)學(xué)院。
 
Lu, Hongwei et al. “Hydrogen (氫氣) Alleviates Oste骨關(guān)節(jié)炎rthritis by Inhibiting Apoptosis and Inflammation via the JNK Signaling Pathway.” Journal of inflammation research vol. 14 1387-1402. 13 Apr. 2021, doi:10.2147/JIR.S297622
 
氫氣治療關(guān)節(jié)炎非常有價(jià)值，本研究從細(xì)胞凋亡和炎癥角度開展研究，主要意義是尋找氫氣效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，但更重要的意義在于氫氣對關(guān)節(jié)炎作用本身，特別是氫氣對人類關(guān)節(jié)炎效果到底是否存在，這種效果和其他治療藥物的優(yōu)劣，這才是使用氫氣治療關(guān)節(jié)炎的根本。不解決這些問題，氫氣作用的分子機(jī)制有何意義，氫氣對動物的關(guān)節(jié)炎研究有何價(jià)值。
 
摘要
骨關(guān)節(jié)炎是一種非常常見的疾病，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、殘疾和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制與大量炎癥和凋亡細(xì)胞因子密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，氫氣具有選擇性抗氧化作用，其中許多作用和JNK途徑相關(guān)，如抗凋亡、抗炎和抗氧化特性。氫氣是否通過JNK信號通路對骨關(guān)節(jié)炎有保護(hù)作用尚不清楚。本研究的目的是了解氫是否對軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。
軟骨細(xì)胞取自人軟骨組織。用TBHP刺激細(xì)胞，用氫氣處理。采用Western blot、RT PCR、免疫熒光和TUNEL法評價(jià)體外處理效果。建立了小鼠內(nèi)側(cè)半月板(DMM)不穩(wěn)定模型，并用氫氣處理。采用x射線成像、軟骨細(xì)胞番紅O染色、細(xì)胞凋亡TUNEL染色和免疫組化方法評價(jià)體內(nèi)治療效果。
 
我們的研究結(jié)果顯示，氫可以抑制tbhp誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中的炎癥因子(ADAMTS5和MMP13)和凋亡因子(cleaved caspase-3、細(xì)胞色素c和Bax)。氫可以抑制JNK信號通路的激活，而氫的作用可以被茴香霉素(JNK激活劑)消除。體內(nèi)結(jié)果顯示，氫可以下調(diào)p-JNK的表達(dá)和caspase-3活性片段的表達(dá)。
 
我們發(fā)現(xiàn)氫氣可通過抑制JNK信號通路緩解人軟骨細(xì)胞的凋亡和ECM降解。手術(shù)誘導(dǎo)的DMM小鼠模型中，氫氣治療可以延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。
 
介紹
骨關(guān)節(jié)炎是一種不可逆的關(guān)節(jié)炎變性狀態(tài)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的不穩(wěn)定的關(guān)節(jié)，其病理特征是關(guān)節(jié)軟骨退行性，進(jìn)行性軟骨下硬化癥，骨贅的發(fā)生，以及滑膜炎癥作為最普遍的慢性關(guān)節(jié)炎類型，其對日常活動的影響在老年人中尤其突出。大量研究已經(jīng)確定了一系列骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的影響因素，包括炎癥、衰老、肥胖、創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)變形、骨質(zhì)疏松等。盡管如此，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。氧化應(yīng)激和炎癥已被證明是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素。此外，大量骨關(guān)節(jié)炎因子可引起氧化還原失衡，促進(jìn)軟骨細(xì)胞刺激導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎主要以改善關(guān)節(jié)功能、緩解疼痛為主。然而，該治療方案并不能緩解骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。因此，探索新的骨關(guān)節(jié)炎治療策略是必要的。
 
氫氣是一種無色無味的氣體。它具有多種生物活性，包括抗炎和抗氧化特性。1975年，Dole等人發(fā)現(xiàn)97.5%的氫氣可用于癌癥治療。Ohta S發(fā)現(xiàn)，2%濃度的氫氣可以改善線粒體疾病，因?yàn)樗梢匝杆贁U(kuò)散到組織和細(xì)胞。Ohsawa等觀察到吸入1-4% 氫氣可以通過選擇性減少細(xì)胞毒性氧自由基來顯著減輕腦缺血再灌注損傷。
 
前期研究表明JNK信號通路可調(diào)控炎癥和細(xì)胞凋亡。當(dāng)受到TBHP(過氧化叔丁醇)等刺激時(shí)，JNK的激活會導(dǎo)致c-Jun的磷酸化。c-Jun降低了蛋白多糖的合成，增強(qiáng)了基質(zhì)金屬蛋白酶-13 (MMP-13)的產(chǎn)量。Gao等發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT-1可以通過JNK信號通路抑制細(xì)胞凋亡和軟骨基質(zhì)降解。Jiang等人發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1抑制il -1β誘導(dǎo)的NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Bax/Bcl-2信號通路的激活JNK通路的激活刺激了Bax、Cytochrome c、cleaved caspase-3等凋亡介質(zhì)的產(chǎn)生。因此，抑制JNK通路的激活可能是一種很有前途的治療策略。最近的一項(xiàng)研究表明，氫氣可以通過降低MMP-13和增加II型膠原酶(Col II)的表達(dá)來抑制氧化損傷。但目前尚不清楚氫氣是否通過JNK通路介導(dǎo)其在骨關(guān)節(jié)炎中的保護(hù)作用。
 
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)氫氣在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮軟骨保護(hù)作用，并在體內(nèi)和體外條件下探索其潛在機(jī)制。在這里，軟骨細(xì)胞暴露于過氧化叔丁醇(TBHP)體外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。我們發(fā)現(xiàn)氫氣可能通過JNK通路抑制過氧化叔丁醇誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥。此外，茴香霉素激活JNK可消除氫氣的抗凋亡和抗炎作用。因此，氫氣通過JNK信號通路抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕骨關(guān)節(jié)炎。我們的研究突出了氫氣在骨關(guān)節(jié)炎中的治療潛力，并探討了氫氣在軟骨細(xì)胞中的抗凋亡和抗炎作用機(jī)制。
 
材料和方法：
人類骨關(guān)節(jié)炎的組織采集和實(shí)驗(yàn)得到溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬倫理委員會(倫理線:LCKY-2019-67)和育英未知兒童醫(yī)院的批準(zhǔn)，并遵循赫爾辛基宣言的指導(dǎo)原則。本研究的受試者均獲得知情同意。
 
小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的建立
 
本實(shí)驗(yàn)取10周齡C57BL/6雌性小鼠45只，來自中國科學(xué)院上海動物中心。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，用顯微外科剪刀剪斷內(nèi)側(cè)半月板的脛骨韌帶建立骨關(guān)節(jié)炎模型。假手術(shù)組小鼠左膝關(guān)節(jié)也行不處理內(nèi)側(cè)半月板韌帶的關(guān)節(jié)切開術(shù)。術(shù)后將小鼠隨機(jī)分為三組(n = 15):假手術(shù)組、骨關(guān)節(jié)炎組(DMM)和骨關(guān)節(jié)炎組(DMM + 75% 氫氣)。每天吸入氣體1小時(shí)。
 
x射線成像檢測
術(shù)后8周對小鼠進(jìn)行影像學(xué)評估。使用x光機(jī)確定骨贅的形成、關(guān)節(jié)間隙和軟骨表面鈣化。
 
組織病理分析
Safranin-O/Fast Green檢測關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。光鏡下觀察小鼠軟骨細(xì)胞及其周圍組織的形態(tài)學(xué)變化。通過國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(骨關(guān)節(jié)炎RSI)的脛骨髁內(nèi)側(cè)和股骨內(nèi)側(cè)平臺評分系統(tǒng)評估關(guān)節(jié)軟骨的破壞情況。
 
TUNEL染色
在固定軟骨細(xì)胞或軟骨切片后，根據(jù)制造商的說明，使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(Roche, Basel, Switzerland)在黑暗潮濕的房間進(jìn)行TUNEL染色。接下來，用DAPI染色細(xì)胞核。熒光顯微鏡下檢測凋亡細(xì)胞DNA鏈斷裂陽性染色。
 
免疫組織化學(xué)分析
首先對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行4%多聚甲醛(PFA)固定、脫鈣、石蠟包埋，并切成7個(gè)µm切片進(jìn)行脫親和復(fù)水化處理。然后，在37℃下，使用過氧化氫(3% v/v)和胰蛋白酶edta溶液(0.25%)對組織學(xué)切片進(jìn)行30分鐘處理。這些切片在37°C BSA(10%)中孵育60分鐘后，在4°C用抗caspase-3和P-JNK的一抗處理24小時(shí)。然后，在第2天使用酶標(biāo)第二抗體在4°C下切片孵育1 h。在image - pro Plus 6.0版輔助下完成圖像分析，定量分析采用每組5個(gè)切片。
 
人軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
首先，我們從10例在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)炎患者(男女各占一半，年齡54±8歲)中收集人類軟骨組織，將其切成小塊，用PBS沖洗3次。然后，用膠原酶II在37°C下孵育4 h。800 rpm離心6 min后，將消化后的軟骨組織懸液放入燒瓶中進(jìn)行組織培養(yǎng)。在37°C，軟骨細(xì)胞在5% CO2氣氛下，使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔一天更換一次培養(yǎng)基。我們使用胰蛋白酶傳代培養(yǎng)人類細(xì)胞，直到達(dá)到80 ~ 90%的融合。
 
氫氣的使用方法
實(shí)驗(yàn)前，氫氣儲存在氣瓶中。然后混合氫氣、氧氣和氮?dú)?，通過三路連接調(diào)整氫氣濃度(6.25、12.5、25、50、75% (vol/vol)，用TRACE GC Ultra氣相色譜法測定。每組中除去一定體積的氫氣后，將剩余體積按空氣中氮?dú)夂脱鯕獾谋壤旌?，?/span>0.78:0.21。用TBHP預(yù)處理軟骨細(xì)胞24 h，并將氫氣導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞4 h。
 
CCK-8
按照制造商的說明，使用CCK-8試劑盒檢測氫氣對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性。首先，將細(xì)胞以每cm2 50000個(gè)細(xì)胞的密度鍍于96孔板中24小時(shí)，并與不同濃度的氫氣(0、12.5、25、50和75%)孵育4小時(shí)。然后，在PBS中沖洗3次。最后，每孔加入10 mol/L CCK-8溶液2 h，在450 nm波長下用分光光度計(jì)觀察光密度。
 
統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了三次。所得數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism(美國)進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析，然后采用Tukey檢驗(yàn)。P < 0.05的概率值認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 
結(jié)果
 
 
氫氣抑制小鼠DMM模型中骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。這個(gè)結(jié)果最重要，三種比較，第一是正常情況，二是關(guān)節(jié)炎，有一些軟骨消失，表現(xiàn)為紅色變淡，氫氣治療后恢復(fù)正常。
 
 
氫氣抑制骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨細(xì)胞凋亡。
 
 
氫氣對人軟骨細(xì)胞活力的影響。
氫氣在tbhp誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用
 
氫氣對tbhp誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞凋亡的影響。
 
 
氫氣對tbhp誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
 
氫氣在tbhp誘導(dǎo)的人類軟骨細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用
 
氫氣對tbhp誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞ECM合成的影響。
 
骨關(guān)節(jié)炎是一種以長期疼痛和關(guān)節(jié)受限為特征的慢性關(guān)節(jié)退化疾病目前治療骨關(guān)節(jié)炎的選擇是早期應(yīng)用非甾體抗炎藥物(NSAIDs)，但它們僅能緩解臨床癥狀。此外，它們還會導(dǎo)致一系列副作用，如心臟病發(fā)作和中風(fēng)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)仍然是骨關(guān)節(jié)炎晚期治療的唯一選擇。因此，一種能夠阻止骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展且副作用少的藥物是骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療策略。最近，越來越多的關(guān)注集中在抗凋亡化合物，可能能夠治療骨關(guān)節(jié)炎而沒有有害的副作用生化和生物力學(xué)事件誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中ECM的凋亡和分解代謝和合成代謝之間的失衡在細(xì)胞和動物模型中，一些基因調(diào)控細(xì)胞凋亡的藥物治療已經(jīng)顯示了對骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的治療作用因此，研究軟骨細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的一種潛在途徑。
 
氧化應(yīng)激是軟骨細(xì)胞凋亡的主要過程。當(dāng)TBHP刺激軟骨細(xì)胞時(shí)，它們產(chǎn)生ROS，如超氧陰離子(O2−)、氫氣O2和羥基自由基(OH);這導(dǎo)致線粒體損傷并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡越來越多的研究發(fā)現(xiàn)過量的ROS會導(dǎo)致軟骨的降解和軟骨細(xì)胞的凋亡。因此，降低ROS的產(chǎn)生可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的有效策略。有趣的是，氫是一種抗氧化化合物。
 
氫是自然界中最輕的元素，是最簡單和最豐富的元素許多研究報(bào)道了氫氣在幾種疾病中的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。他們證明吸入4%氫氣是一種安全有效的治療人類疾病的方法。氫氣因其制備簡單、安全性高、滲透性強(qiáng)、便于攜帶而引起了研究人員的注意。16Peng Guan等發(fā)現(xiàn)氫氣通過JNK信號通路改善了慢性間歇性缺氧(CIH)誘導(dǎo)的腎損傷Zhao等發(fā)現(xiàn)氫氣通過阻斷c-Jun n -末端激酶(JNK)-MAPK.36，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡Wu等發(fā)現(xiàn)，氫氣通過抑制新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的凋亡和炎癥反應(yīng)而減輕腦損傷37Chen等發(fā)現(xiàn)吸入氫可以改善小鼠脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元的凋亡和氧化應(yīng)激JNK通路是經(jīng)典的促凋亡通路，已被證明在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究表明，尿石素A、人參皂苷、木犀草素等藥物通過抑制JNK信號通路的激活來保護(hù)軟骨細(xì)胞。因此，靶向下調(diào)JNK磷酸化可能被認(rèn)為可以有效治療骨關(guān)節(jié)炎。
 
因此，在本研究中，我們通過JNK信號通路探索氫氣對人軟骨細(xì)胞的抗凋亡能力。在tbhp處理的人類軟骨細(xì)胞中，氫氣明顯抑制JNK的磷酸化。由于JNK通路的活性被抑制，Bax和cleaved caspase-3等凋亡因子的產(chǎn)生被下調(diào)，從而改善了骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。總的來說，我們的數(shù)據(jù)表明氫氣在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中具有抗凋亡活性，這在thbp處理的軟骨細(xì)胞上得到了證實(shí)，JNK通路可能參與了其作用機(jī)制。因此，氫氣的作用是明顯的。此外，與假手術(shù)組相比，DMM組關(guān)節(jié)間隙縮小，ECM降解，軟骨嚴(yán)重受損，蛋白多糖嚴(yán)重缺乏。經(jīng)氫氣治療后，上述癥狀均得到改善，小鼠DMM模型骨關(guān)節(jié)炎RSI評分降低。軟骨的TUNEL染色和cleaved caspase-3的IHC染色顯示，氫氣可以緩解軟骨的凋亡。此外，氫氣參與JNKs信號通路，改善了骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。綜上所述，這些結(jié)果和前期研究結(jié)果表明，通過抑制JNK通路的激活，氫氣對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有改善作用(圖8)。
 
 
示意圖揭示了氫氣通過JNK通路的參與以及在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的潛在保護(hù)作用。
 
有趣的是，人們研究了氫在不同濃度下對各種疾病的治療效果。本研究采用高氫氣濃度(6.23-75%)研究氫氣對骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。
 
綜上所述，發(fā)現(xiàn)氫氣通過使JNKs信號通路失活來減輕人軟骨細(xì)胞的凋亡反應(yīng)和ECM降解。同時(shí)，在手術(shù)誘導(dǎo)的DMM小鼠模型中，氫氣治療對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展也有重要作用。數(shù)據(jù)表明氫氣具有抗骨關(guān)節(jié)炎保護(hù)活性。