研究背景:膿毒癥是全身炎癥反應(yīng)引起的綜合征,膿毒癥晚期全身多器官功能發(fā)生障礙常常危及生命健康。全世界范圍內(nèi),膿毒癥仍然有較高的發(fā)病率和病死率,并給社會帶來巨大的負擔。大腦是膿毒癥易累及器官之一,膿毒癥時腦損傷的嚴重程度與患者預(yù)后密切相關(guān)。因此,針對膿毒癥相關(guān)性腦病的防治研究具有重要意義。線粒體是細胞能量和代謝的核心,通過氧化磷酸化為細胞正常生理活動提供能量。線粒體功能異常與膿毒癥引起的器官功能障礙密切相關(guān)。改善膿毒癥時細胞線粒體功能異常對膿毒癥患者的預(yù)后及存活率具有重要意義。線粒體質(zhì)量控制,包括線粒體生物合成、線粒體自噬、線粒體融合和分裂,在線粒體功能恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。線粒體生物合成是產(chǎn)生新線粒體的過程,這些新生成的功能正常的線粒體通過融合和分裂形成線粒體網(wǎng)絡(luò),而發(fā)生損傷和功能異常的線粒體則通過線粒體自噬清除。自日本Ohsawa教授證明低濃度氫氣（2%4%）具有抗氧化作用后,氫醫(yī)學的研究成為一大熱點。目前已證實氫氣具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用,而且對膿毒癥器官功能障礙有一定的治療作用。另外有研究證實,氫氣可以通過改善線粒體功能,促進線粒體生物合成、線粒體自噬和線粒體分裂、抑制線粒體融合減輕膿毒癥器官損傷[1-3]。本實驗擬探討氫氣對膿毒癥相關(guān)性腦病小鼠海馬組織線粒體動力學和功能的影響,以及氫氣調(diào)控線粒體生物合成的機制。第一部分:氫氣調(diào)控線粒體動力學平衡和功能減輕膿毒癥相關(guān)性腦病目的:探討氫氣對膿毒癥相關(guān)性腦病小鼠海馬組織線粒體功能和線粒體動力學的影響。
方法:健康雄性野生型C57BL/6J小鼠共計316只,周齡6-8周,體重20～25 g,隨機分為4組（n=79）:假手術(shù)組（Sham組）,假手術(shù)+氫氣組（Sham+H2組）,膿毒癥組（CLP組）和膿毒癥+氫氣組（CLP+H2組）。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture,CLP）制備小鼠膿毒癥相關(guān)性腦病模型。手術(shù)后1 h和6 h,Sham+H2組和CLP+H2組小鼠吸入2%氫氣1 h,其余兩組吸入空氣。造模后觀察各組小鼠7 d生存情況。于手術(shù)后3 d、5 d和7 d進行Y-迷宮實驗檢測小鼠工作記憶能力。手術(shù)后24小時,Nissl染色觀察腦組織病理改變,TUNEL染色觀察凋亡情況,使用透射電鏡觀察線粒體形態(tài),使用試劑盒檢測腦組織炎癥因子水平、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）、線粒體ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性和線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性,使用Western blot檢測線粒體生物合成和線粒體融合/分裂相關(guān)蛋白的表達情況。
結(jié)果:氫氣吸入明顯提高膿毒癥小鼠的7 d存活率（P<0.05）。Y-迷宮實驗顯示膿毒癥時小鼠的自發(fā)交替百分比下降,而氫氣治療提高了小鼠的自發(fā)交替百分比（P<0.05）。Nissl染色、TUNEL凋亡和投射電鏡顯示膿毒癥時小鼠神經(jīng)元及海馬組織線粒體損傷明顯,神經(jīng)元凋亡增加,氫氣治療減輕神經(jīng)元和海馬組織線粒體損傷,減少細胞凋亡。與Sham組相比,CLP組小鼠海馬組織中TNF-α和IL-6升高（P<0.05）;與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織中TNF-α和IL-6下降（P<0.05）。與Sham組相比,CLP組小鼠海馬組織MMP、ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性降低（P<0.05）;與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織MMP、ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性升高（P<0.05）。各組海馬組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合物II活性無差異（P>0.05）。與Sham組相比,CLP組小鼠海馬組織線粒體生物合成相關(guān)蛋白（PGC-1α、NRF2、Tfam）表達增加（P<0.05）;與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織線粒體生物合成相關(guān)蛋白（PGC-1α、NRF2、Tfam）表達進一步增加（P<0.05）。與Sham組相比,CLP組小鼠海馬組織Drp1表達增加（P<0.05）,Mfn2表達減少（P<0.05）;與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織Drp1表達減少（P<0.05）,Mfn2表達增加（P<0.05）。結(jié)論:氫氣治療提高膿毒癥小鼠存活率,改善認知功能,減輕膿毒癥引起的腦損傷,具有抗凋亡、抗炎作用。氫氣對膿毒癥相關(guān)性腦病的保護作用與其改善線粒體功能,調(diào)節(jié)線粒體生物合成和線粒體融合/分裂有關(guān)。第二部分:氫氣激活PGC-1α促進線粒體生物合成減輕膿毒癥相關(guān)性腦病目的:探討氫氣對膿毒癥相關(guān)性腦病小鼠海馬組織線粒體生物合成的影響及相關(guān)機制。
方法:健康雄性野生型C57BL/6J小鼠共計244只,周齡6-8周,體重20～25 g,隨機分為4組（n=61）:膿毒癥組（CLP組）,膿毒癥+氫氣組（CLP+H2組）,膿毒癥+PGC-1α抑制劑組（CLP+SR-18292組）和膿毒癥+PGC-1α抑制劑+氫氣組（CLP+SR-18292+H2組）。采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備小鼠膿毒癥相關(guān)性腦病模型。手術(shù)前3 d,CLP+SR-18292組和CLP+SR-18292+H2組小鼠每天腹腔注射PGC-1α抑制劑SR-18292（45 mg/kg）[4]。手術(shù)后1 h和6 h,CLP+H2組和CLP+SR-18292+H2組小鼠吸入2%氫氣1 h,其余兩組吸入空氣。手術(shù)后24 h,使用Western blot檢測線粒體生物合成相關(guān)蛋白的表達情況。造模后觀察各組小鼠7 d生存情況。于手術(shù)后3 d和5 d進行Y-迷宮實驗檢測小鼠工作記憶能力。手術(shù)后24 h,TUNEL染色觀察凋亡情況,使用試劑盒檢測線粒體膜電位（MMP）、線粒體ATP含量、線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性。結(jié)果:與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織乙酰化PGC-1α表達減少,而NRF2和Tfam表達增加（P<0.05）;與CLP+H2組相比,CLP+SR-18292+H2組小鼠海馬組織乙?；疨GC-1α表達增加,而NRF2和Tfam表達減少（P<0.05）。與CLP組相比,CLP+H2組小鼠的7 d存活率明顯增加（P<0.05）;與CLP+H2組相比,CLP+SR-18292+H2組小鼠的7 d存活率明顯下降（P<0.05）。Y-迷宮實驗顯示而氫氣治療提高了膿毒癥小鼠的自發(fā)交替百分比,而使用PGC-1α抑制劑SR-18292逆轉(zhuǎn)了氫氣改善膿毒癥小鼠工作記憶能力的作用（P<0.05）。TUNEL凋亡顯示氫氣治療減少神經(jīng)元細胞凋亡,而CLP+SR-18292+H2組小鼠海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡明顯增加。與CLP組相比,CLP+H2組小鼠海馬組織MMP、ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性升高（P<0.05）;與CLP+H2組相比,CLP+SR-18292+H2組小鼠海馬組織MMP、ATP含量和線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性下降（P<0.05）。
結(jié)論:氫氣通過去乙?；せ詈ｑR組織PGC-1α促進線粒體生物合成,改善線粒體功能,減輕膿毒癥引起的腦損傷。