富氫水減輕腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞自噬性死亡的研究

文章來源：admin發(fā)布日期：2024-06-20 15:06瀏覽次數(shù)：

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目的:探究富氫水是否可降低腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)后大鼠腦組織中死亡相關(guān)蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1,DAPK1)的表達(dá),并減輕神經(jīng)細(xì)胞自噬性死亡,從而改善神經(jīng)功能。
方法:將63只大鼠隨機分為7個組,假手術(shù)組(Sham)為1個組,模型組(CIR)組分為再灌注12h、24h、48h時間點3個亞組,富氫水(CIR+HW)組分為再灌注12h、24h、48h時間點3個亞組,每組9只。Sham組大鼠僅進(jìn)行血管分離,術(shù)后立即生理鹽水5ml/kg腹腔注射;CIR組大鼠插入線栓建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery embolization,MCAO)模型,缺血1.5h后拔出線栓進(jìn)行再灌注,術(shù)后立即生理鹽水5ml/kg腹腔注射;CIR+HW組大鼠同樣建立MCAO模型,缺血1.5h后拔出進(jìn)行再灌注,術(shù)后立即富氫水5ml/kg腹腔注射。觀察各組大鼠行為學(xué)變化,并在相應(yīng)時間點進(jìn)行改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度(modified neurological severity score,m NSS)評分,之后于相應(yīng)時間點麻醉后處死大鼠并收集腦組織標(biāo)本。各組大鼠隨機選擇3只,取完整大腦組織進(jìn)行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenylt-etrazolium chloride,TTC)染色檢測梗死體積;剩余各組大鼠取材后在掃描電鏡下觀察腦組織的細(xì)胞形態(tài)、透射電鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)檢測DAPK1、Beclin1、空泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting 34,VPS34)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-B(microtubule-associated protein light chain 3-B,LC3-B)m RNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)檢測DAPK1、Beclin1、VPS34、LC3-B蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:與Sham組比,各時間點CIR組和CIR+HW組大鼠的m NSS評分顯著增高;與CIR組比,48h時間點CIR+HW組大鼠的mNSS評分較CIR組顯著降低(P<0.05)。與Sham組比,各時間點CIR組和CIR+HW組大鼠腦組織TTC染色可見明顯梗死灶;與CIR組比,各時間點CIR+HW組大鼠的腦梗死體積均顯著減少(P<0.05)。Sham組大鼠腦組織掃描電鏡下可見細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;各時間點CIR組大鼠腦組織明顯水腫,大量神經(jīng)細(xì)胞核周圍空泡改變,部分細(xì)胞核變形、碎裂,結(jié)構(gòu)疏松,胞漿淡染,微血管皺縮或破壞,淋巴細(xì)胞浸潤;各時間點CIR+HW組與CIR組大鼠掃描電鏡下比較,腦組織水腫稍減輕,神經(jīng)細(xì)胞核周圍空泡減少,核變形和破裂少見,結(jié)構(gòu)稍緊密,胞漿淡染,微血管皺縮破壞減少,淋巴細(xì)胞浸潤減少。Sham組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;12h時間點CIR組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)見神經(jīng)細(xì)胞水腫,細(xì)胞膜部分缺失,細(xì)胞器分布雜亂,線粒體多數(shù)腫脹、脊斷裂,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,胞內(nèi)見自噬小體和自噬溶酶體,胞核呈橢圓形,核膜部分?jǐn)嗔?核仁邊移;12h時間點CIR+HW組與12h時間點CIR組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)比較,同樣可見神經(jīng)細(xì)胞水腫,細(xì)胞膜缺失,細(xì)胞器雜亂分布,但線粒體腫脹和脊斷裂減少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張減輕,自噬體形成減少,胞核呈橢圓形,核膜完整,核仁稍有邊移。與Sham組比,各時間點CIR組和CIR+HW組大鼠腦組織中的DAPK1、Beclin1、VPS34、LC3-B m RNA的表達(dá)量均顯著增加(P<0.05);與CIR組比,各時間點CIR+HW組大鼠腦組織中的DAPK1、Beclin1、VPS34、LC3-B m RNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與Sham組比,各時間點CIR組和CIR+HW組大鼠腦組織中的DAPK1、Beclin1、VPS34及LC3-B蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05);與CIR組比,各時間點CIR+HW組大鼠腦組織中的DAPK1、Beclin1、VPS34和LC3-B蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。
結(jié)論:富氫水可以降低CIRI大鼠腦組織中DAPK1的表達(dá),由此下調(diào)其下游自噬相關(guān)因子的表達(dá),減少自噬體的形成,減輕神經(jīng)細(xì)胞自噬性死亡,從而改善神經(jīng)功能。