惡性腫瘤是威脅全球健康的重大疾病,是危重病人死亡的主要原因[1]。毫無疑問,化療作為一種重要的治療方法,目前常用于治療惡性腫瘤[2]。但化療藥物的使用往往會引起許多副作用,而其中,化療藥所致病理性神經(jīng)痛（Chemotherapy-induced neuropathic pain,CINP）是惡性腫瘤治療過程中最常見的合并癥之一,臨床上患者服用化療藥后,會出現(xiàn)全身或部分肢體發(fā)生持續(xù)性的自發(fā)性疼痛,間歇性灼痛,嚴重的痛覺過敏和超敏反應(yīng)。由于其發(fā)病率高達70%,且缺乏有效的治療手段,嚴重影響惡性腫瘤患者的生存質(zhì)量和預(yù)后[3]。分子氫是宇宙中最豐富的元素,作為一種新型的醫(yī)療用氣體分子,對70多種疾病有一定的治療作用[4,5]。

本課題組前期研究表明,飽和富氫生理鹽水處理與2%氫氣吸入,對神經(jīng)病理性疼痛、膿毒癥及缺血再灌注損傷等多種疾病的動物及細胞模型具有良好的保護效應(yīng)[4-8]。人類微生物組包括約50兆的細菌,覆蓋在腸道上皮細胞的表面,與宿主的生長、發(fā)育、物質(zhì)代謝等密切相關(guān)[9]。2017年有研究首次發(fā)文指出,腸道菌群是導(dǎo)致化療痛的主要原因之一,化療藥應(yīng)用只在無特定病原體小鼠模型中產(chǎn)生病理性神經(jīng)痛,而對于無菌小鼠,則不產(chǎn)生化療痛[10]。Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）是一類重要的跨膜蛋白分子,參與非特異性免疫（天然免疫）,Toll樣受體4分子（Toll-like receptor 4,TLR4）是人類發(fā)現(xiàn)的第一個Toll樣受體相關(guān)蛋白,其在非特異性免疫細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞）和T、B型淋巴細胞表面介導(dǎo)特異性免疫反應(yīng),可特異性識別細菌所釋放的內(nèi)毒素/脂多糖LPS[10],結(jié)合后可引發(fā)一系列下游事件的發(fā)生,最終導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)的釋放。目前已發(fā)現(xiàn)腸道菌群可能通過LPS-TLR4途徑影響化療痛的發(fā)展。本實驗擬研究富氫水對于腸道菌群的作用以及對菌群和CINP的調(diào)控機制。目的:探究LPS-TLR4通路在富氫水調(diào)控腸道菌群影響CINP中的表達情況,評價其作用。方法一:采用隨機數(shù)字表發(fā)將76只雌性、6-8周齡、每只體重約為20-25g的C57BL/6J小鼠隨機分為2組,每組38只:普通飲用水組（H2O組）和富氫水組（HW組）。使用高純氫氣發(fā)生器產(chǎn)生H2,將H2吹入飲用水中制備富氫水。H2O組喂養(yǎng)普通飲用水,HW組喂養(yǎng)富氫水,每日更換富氫水,以保證飲用水的氫分子濃度和潔凈度。3周后,采集小鼠糞便進行腸道菌群16S r DNA擴增子測序多樣性分析及代謝組學(xué)分析。方法二:3周的富氫水與正常飲用水喂養(yǎng)后,在此基礎(chǔ)上將采用隨機數(shù)字表法將實驗小鼠分為將76只小鼠隨機分為4組,每組19只:正常飲用水加腹腔注射生理鹽水組（H2O+Saline組）、正常飲用水加腹腔注射奧沙利鉑組（H2O+OXA組）、富氫水加腹腔注射生理鹽水組（HW+Saline組）和富氫水加腹腔注射奧沙利鉑組（HW+OXA組）。H2O組喂養(yǎng)普通飲用水,HW組喂養(yǎng)富氫水,富氫水飲用瓶中的富氫水每日更換,以保證飲用水的氫分子濃度和清潔度。奧沙利鉑組給予腹腔注射奧沙利鉑溶液,生理鹽水組給予等體積腹腔注射生理鹽水。在相應(yīng)的時間內(nèi)測試機械性縮足反應(yīng)閾值,第20d后,收集各組小鼠糞便進行腸道菌群16S r DNA擴增子測序多樣性分析。在收集小鼠糞便后測定炎癥因子和氧化應(yīng)激因子的含量、LPS的含量以及TLR4的水平。結(jié)果一:正常飲用水中不含氫,氫溶解度在各時間點均為0ppb。在開始制備富氫水的10min內(nèi),氫的溶解度隨時間迅速增加至1200ppb。當(dāng)氫溶解度不再增加后降低氫氣的吹出速率,氫溶解度保持在900-1000ppb;與H2O組相比,富氫水可提高正常小鼠腸道菌群的Simpson指數(shù),降低Shannon指數(shù)（P<0.05）;與正常水組小鼠相比,富氫水在門、科和屬水平上均可改變正常小鼠腸道菌群組成的相對豐度（P<0.05）;通過LC-MS/MS篩選出了HW組與H2O組之間的17種差異代謝產(chǎn)物;富氫水還可影響如硫代謝途徑、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑和賴氨酸降解途徑等12種代謝途徑。結(jié)果二:各組小鼠機械性痛閾值的基線沒有顯著差異（P>0.05）,與H2O+OXA組相比,富氫水可顯著改善CINP小鼠的機械性痛覺過敏（P<0.05）;與H2O組相比,富氫水可提高CINP小鼠腸道菌群的Simpson指數(shù),降低Shannon指數(shù)（P<0.05）,飲用相同水的小鼠群落多樣性無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）;富氫水在門、科和屬水平上均可改變CINP小鼠腸道菌群組成的相對豐度（P<0.05）。與Saline組小鼠相比,OXA組小鼠的炎癥因子TNF-α、IL-6、OH-和ONOO-的表達顯著增加（P<0.05）。與H2O+OXA組相比,飲用了富氫水的HW+OXA組的CINP小鼠其DRG中的TNF-α、IL-6、OH-和ONOO-的表達顯著下降（P<0.05）;與Saline組小鼠相比,OXA組小鼠的LPS和TLR4的表達顯著增加（P<0.05）。與H2O+OXA組相比,飲用了富氫水的HW+OXA組的CINP小鼠其血清和DRG中的LPS和TLR4的表達顯著下降（P<0.05）。

結(jié)論:奧沙利鉑可誘發(fā)小鼠機械性痛覺過敏,長期飲用富氫水可緩解CINP小鼠的痛覺過敏。富氫水可改變小鼠腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)。富氫水可能通過DRG中的LPS-TLR4通路緩解奧沙利鉑調(diào)控腸道微生物所致周圍神經(jīng)痛。