肝切除是一種手術(shù)過程，是肝衰竭的高風(fēng)險因素，這可能是致命的。其中一個關(guān)鍵機制涉及缺血-再灌注損傷。眾所周知，氫對減輕這種損傷具有積極作用，這項工作目的是證明在家豬肝臟切除過程中吸入氫對抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用。
 

本研究共使用了12頭家豬，6只動物在全麻時進行了吸入氫切除，6只動物在常規(guī)全麻下進行了相同的手術(shù)。術(shù)中準(zhǔn)備肝門靜脈左支、肝左動脈，并使用止血帶。先誘導(dǎo)熱缺血120分鐘，然后再進行肝臟再灌注120分鐘。然后從肝臟的缺血區(qū)和非缺血區(qū)取出樣本進行組織學(xué)和生化檢查。
 

組織學(xué)變化的評估是基于損傷的數(shù)值表達式基于Suzuki分?jǐn)?shù)。與對照組相比，吸入氫氣組的肝臟組織變化有統(tǒng)計學(xué)意義上的降低。生化指標(biāo)在肝轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LD)、乳酸方面無統(tǒng)計學(xué)差異。然而，一個令人驚訝的結(jié)果是-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GMT)的統(tǒng)計顯著性差異。在血漿樣品中，氧化損傷的標(biāo)記水平變化明顯。
 

本研究發(fā)現(xiàn)在大型動物豬肝臟切除過程中吸入氫氣降低缺血-再灌注損傷相關(guān)氧化應(yīng)激水平。組織學(xué)和機體氧化應(yīng)激直接測定均證實了這一現(xiàn)象。
 

肝臟缺血再灌注損傷是肝功能障礙發(fā)生的重要機制之一，分初始和后期兩個階段。在再灌注最初2小時內(nèi)，枯否氏細胞在缺血刺激下產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，導(dǎo)致急性肝細胞損傷。再灌注后6小時開始晚期階段，中性粒細胞在肝臟內(nèi)積聚，這是眾所周知的ROS來源細胞，可進一步加重肝臟損傷。這兩種產(chǎn)生ROS的細胞都屬于典型的炎癥細胞。
 

肝細胞和血竇內(nèi)皮細胞的線粒體呼吸鏈被破壞，導(dǎo)致缺血-再灌注肝損傷初始階段ROS額外形成。此外，長時間肝缺血會加劇再灌注過程中氧化應(yīng)激發(fā)展。因此，氧化應(yīng)激引起的缺血再灌注損傷在實驗室和臨床研究中都相當(dāng)受重視。
 

雖然造成缺血-再灌注損傷的原因是多因素的，包括缺氧、炎癥反應(yīng)、游離氧自由基損傷和ROS。
 

ROS既包括自由基，也包括非自由基的物質(zhì)，因此，“活性氧”一詞比“自由基”更準(zhǔn)確。自由基是任何化學(xué)實體，原子、分子或離子，其外層電子殼層至少有一個不成對電子，使其具有高度化學(xué)活性，能夠獨立存在。
 

羥基自由基(HO•)是活性最強的活性氧自由基，因此毒性極強。它起源于過渡金屬離子的存在(鐵和銅離子),作為過氧化氫被還原的芬頓反應(yīng)一個產(chǎn)物,或從超氧化物陰離子(O2•−)與過氧化氫反應(yīng)Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生。因為超氧化物陰離子和過氧化氫都能被天然抗氧化劑SOD、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶。然而，沒有任何一種酶可以消除羥自由基。因此，尋找能選擇性地與氫氧自由基發(fā)生反應(yīng)的理想還原劑是極其重要的。
 

近年大量研究表明，氫氣是一種很有前途的抗氧化劑。雖然氫作為一種氣態(tài)元素已經(jīng)有大約250年的研究歷史，但它在體內(nèi)和體外與ROS(羥基自由基- ho•)發(fā)生反應(yīng)的能力直到2007年才被發(fā)現(xiàn)。
 

氫氣是無色、無味、無嗅的，在與氧的混合物中極易爆炸。在大多數(shù)實驗中，通常使用可燃燒最小濃度（4%）的一半(2%)。在人體內(nèi)氫是完全惰性的，沒有毒性作用，即使在數(shù)小時的暴露中也是如此。
 

由于氫氣沒有極性，它能很快穿透所有生物膜，包括亞細胞細胞器。這是它與其他抗氧化劑相比的巨大優(yōu)勢。在連續(xù)吸入2% 氫氣混合,濃度大約8µM，于內(nèi)部和細胞外液艙后約45分鐘。這種濃度在整個吸入期間都保持不變。然后通過呼氣排出氫，半衰期為8－10分鐘。氫氣吸入似乎是最合適的方法，因為吸入后可在生物體迅速飽和和易于維持穩(wěn)定在某一濃度水平。
 

從外科手術(shù)角度來看，肝切除和肝移植保護作用尤為重要。肝切除術(shù)是一種高風(fēng)險手術(shù)，容易伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥。最嚴(yán)重的是術(shù)后肝功能衰竭，可能是致命的。肝功能障礙的關(guān)鍵機制之一是缺血再灌注損傷。鑒于在過去10年的各種臨床試驗中有關(guān)氫的積極作用的信息，評估氫氣在臨床相關(guān)的半肝切除模型中的潛力是合理的，其積極作用可能是特別有利的。
 

在以前發(fā)表的研究中，大多數(shù)使用小型實驗室動物，且只評估選定組織學(xué)和生化數(shù)據(jù)。到目前為止，還沒有發(fā)表過使用大型實驗動物進行肝臟缺血再灌注損傷用氫氣改善的綜合評價，這些研究可使用組織學(xué)和生化標(biāo)志物，包括氧化應(yīng)激標(biāo)志物，這些標(biāo)志物可用于在分子水平上評估氧化損傷的實驗研究。
 

因此，本研究目的是通過組織學(xué)和生化檢查以及氧化損傷標(biāo)志物的檢測，證實吸入氫對家豬大肝切除過程中抗氧化、抗炎和抗凋亡的積極作用。
 

本研究納入12只實驗動物(家豬)，隨機分為兩組，每組6只(氫氣改善干預(yù)組和對照組)。動物平均體重為32.5±2.2 kg。經(jīng)皮切口至門靜脈左支止血帶、左肝動脈止血帶的平均手術(shù)時間為30±7.2分鐘。
 

評估缺血-再灌注損傷引起的組織學(xué)變化的依據(jù)是竇道充血、空泡化(球囊變性)和肝細胞壞死的程度，然后根據(jù)Suzuki評分對損傷嚴(yán)重程度進行數(shù)值表達。采用“干預(yù)組”(n=6)與“對照組”(n=6)、“左(缺血性)葉”(n=6)與“右(非缺血性)葉”(n=6)進行雙向方差分析(ANOVA)。干預(yù)組左葉平均得分為1.000±0.274(左×無氫)，對照組平均得分為1.667±0.274(左×無氫)，兩組平均值相差66.7%。干預(yù)組右葉(非缺血區(qū))Suzuki評分均值為0.167±0.274(右×無氫)，對照組為0.833±0.274(右×無氫)，平均差異為398%(見圖1)。

圖1
 

使用鈴木評分與使用雙向方差分析(ANOVA)比較肝損傷評分。左邊，肝臟的左葉;肝臟的右葉;氫,干預(yù)組;沒有氫，是對照組。
 

因此，使用氫氣的干預(yù)組的肝臟樣本與對照組相比，組織學(xué)變化有統(tǒng)計學(xué)意義(氫氣對比對照組，P=0.024)。這些差異在非缺血性腦葉和缺血性腦葉(左×右，P=0.006)均可見。
 

生化檢查顯示的測量值沒有統(tǒng)計上的重要區(qū)別。肝轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LD)和乳酸(見表3),肌酸激酶值(包括亞型BB)似乎完全隨機的非標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計,因此,我們未能確認Vaubourdolle等的發(fā)現(xiàn)。
 

然而，干預(yù)組和對照組之間的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GMT)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。其水平在手術(shù)過程中波動最小;而干預(yù)組的測量值平均比對照組高2.5倍(圖3)。
 

采用單因素方差分析(ANOVA)比較對照組和干預(yù)組實驗期間-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GMT)水平。
 

氧化損傷標(biāo)記物

 

氧化損傷標(biāo)志物水平差異顯著，尤其在血漿樣品中(見表4)。氫處理干預(yù)組MDA和3-NT水平明顯低于對照組，表明氧化應(yīng)激程度較低。相應(yīng)地，谷胱甘肽和NP-SH水平顯著升高，其氧化產(chǎn)物(非蛋白質(zhì)二硫化物)水平顯著降低。與肝臟非缺血葉(右側(cè))和缺血葉(左側(cè))相比，肝臟組織有顯著性差異(見表5)。
 

表4血漿氧化損傷標(biāo)志物

 

討論

 

肝切除是一種高風(fēng)險的手術(shù)，常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥，術(shù)后肝功能衰竭是最嚴(yán)重的手術(shù)之一，極易致命。肝功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵機制之一是缺血再灌注損傷。在這項實驗研究中，我們在一個臨床相關(guān)的肝缺血-再灌注損傷模型中，評估了吸入氫對家豬的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。通過組織學(xué)和生化檢查(包括氧化損傷標(biāo)記的檢查)來評估這些影響。
 

吸入似乎是手術(shù)過程最適合的給氫氣形式，因為它快速組織飽和和易于保持恒定水平。其他可能的給藥方法包括靜脈注射富氫生理鹽水和飲用富氫飲用水。
 

2001年，發(fā)表了第一個關(guān)于高壓下氫氣對肝臟損傷的保護作用的研究。2007年進一步探討了氫對肝臟缺血的改善作用。關(guān)于氫對肝臟組織影響的研究相對較新，肝病的研究方法和類型也有很大的差異。
 

在最早研究，Gharib等人研究了分子氫對患有慢性寄生蟲性肝病小鼠模型的影響。小鼠在高壓氧艙中呼吸氫氣和氧氣的混合物14天(87.5%的氫氣，0.7MPa)。作者觀察了肝功能、肝組織氧化損傷、肝纖維化和炎癥癥狀，并得出結(jié)論，持續(xù)高劑量氫對肝功能有顯著保護作用。這項研究首次證明了氫的抗炎和抗氧化作用。由于氫劑量如此之高，該研究在臨床應(yīng)用方面的可轉(zhuǎn)化性有限。2007年，Ohsawa等人發(fā)表了另一項重要研究，表明同樣抗氧化效果可以通過吸入2%氫35分鐘來實現(xiàn)。因為2%這種濃度非常容易實現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)具有更大臨床潛力。Fukuda等人利用大鼠模型發(fā)表了一篇關(guān)于氫對缺血-再灌注肝損傷影響的研究。作者發(fā)現(xiàn)，根據(jù)組織學(xué)切片和丙二醛水平和肝臟測試，氫對缺血性肝損傷有顯著的影響。2009年，Kajiya等人證明了氫對伴刀豆凝集素A型肝炎的保護作用。同年，Tsai等人發(fā)現(xiàn)富氫水對四氯化碳誘導(dǎo)的肝炎小鼠的肝臟組織有保護作用。孫漢勇等人證明，氫不僅可以保護肝臟免受損傷，還可以幫助預(yù)防三種不同的肝硬化模型。劉等研究發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)應(yīng)用富氫液體可提高肝臟抗氧化能力，減少炎癥反應(yīng)，具有重要的臨床意義。目前的研究表明，長期飲用富氫水可以改善非酒精性脂肪性肝炎的癥狀，改善肝功能和肝臟形態(tài)(在預(yù)防纖維化方面)。在這項研究中，作者不僅證明了富氫水對改善肝功能的長期作用，而且還證明了它可以降低患惡性腫瘤的風(fēng)險。這有力地證明了氫在預(yù)防癌癥方面也有應(yīng)用價值。Kang等人發(fā)現(xiàn)，每天使用富氫水可以改善接受肝腫瘤放療的患者的生活質(zhì)量。這種影響可以通過減少放療引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來解釋。另一項研究表明，氫對肥胖糖尿病患者具有預(yù)防肝脂肪纖維化和降低胰島素抵抗的積極作用。2013年，Xia等人發(fā)表了一項研究結(jié)果，30名慢性乙型肝炎患者使用富氫水6周。與對照組相似的患者相比，這些患者的肝功能得到改善，循環(huán)HBV DNA水平降低。2015年，Zhang等人發(fā)表了一項研究結(jié)果，該研究觀察了接受同基因原位肝移植的大鼠。在移植前，他們吸入1-3%的混合氫。吸入2%混合氫的大鼠表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)偷娜毖?再灌注肝損傷。Lin等人在2017年發(fā)表了一項研究，證實了富氫水對乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠的抗氧化作用。小鼠肝臟功能改善，丙二醛水平降低，內(nèi)在天然清道夫機制功能增強。最近，Uto等人在同基因原位肝移植前使用富含溶解氫的UW溶液儲存肝臟。與對照組相比，肝臟移植顯示出較低的氧化損傷和較低的凋亡肝細胞數(shù)目。最后，Ge等在小型豬腹腔鏡肝切除術(shù)中顯示了氫氣的保護作用。手術(shù)后,動物表現(xiàn)出低水平的炎癥標(biāo)記物和皮質(zhì)醇。
 

上述研究表明，氫在肝臟缺血、肝炎、脂肪變性和其他肝臟疾病中具有顯著的抗氧化潛力。
 

缺血再灌注損傷后組織學(xué)變化的評估采用Suzuki評分進行半定量表達。干預(yù)組的肝臟樣本，即與對照組相比，吸入氫氣組組織學(xué)變化有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，干預(yù)組非缺血性腦葉的組織學(xué)改變幾乎可以忽略不計。結(jié)果表明，在組織學(xué)水平上，氫氣使用顯著降低了肝缺血再灌注損傷的程度。
 

生化檢測結(jié)果顯示肝轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)、ALP、LD、乳酸無統(tǒng)計學(xué)差異。雖然AST的圍手術(shù)期水平升高，但升高可能是由于開腹手術(shù)中發(fā)生的肌肉組織損傷所致。兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肌酸激酶值(包括BB亞型)似乎完全隨機，且無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，我們未能證實Vaubourdolle等人的結(jié)論，從我們的結(jié)果來看，肌酸激酶BB不能作為判斷肝缺血再灌注損傷程度的簡單指標(biāo)。同樣，我們也未能證明常規(guī)肝功能檢查可以作為肝缺血-再灌注損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。然而，一個令人驚訝的結(jié)果是-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GMT)水平在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。雖然在手術(shù)過程中水平波動很小，但干預(yù)組平均值是對照組的2.5倍。GMT值升高與ALP升高相結(jié)合，通常被認為是膽道損傷的一個標(biāo)志。但本研究所有測量值均在生理范圍內(nèi)。因此，不同水平的GMT可能是由于氧化應(yīng)激水平較高時GMT分子的氧化損傷，導(dǎo)致血液中GMT水平降低。因此，GMT水平可以作為術(shù)后早期缺血-再灌注損傷嚴(yán)重程度的預(yù)測因素。這一假設(shè)與Belcastro等人的一項研究一致，在該研究中，作者觀察到GSH、NP-SH水平下降(參見氧化損傷標(biāo)記物)，以及GMT活性隨著氧化應(yīng)激的增加而下降3.5倍的現(xiàn)象，正如我們在研究中觀察到的那樣。
 

血漿中氧化損傷的標(biāo)記物存在顯著差異。干預(yù)組(吸入氫氣組)MDA和3-NT水平明顯低于對照組，說明氧化應(yīng)激程度較低。因此，干預(yù)組的GSH和NP-SH水平顯著升高，其氧化產(chǎn)物(非蛋白質(zhì)二硫化物; NP-SS-NP)，這與本研究方法所提出的假設(shè)相符。肝組織與肝臟非缺血葉(右)和缺血葉(左)相比均有顯著性差異。血漿和肝組織中谷胱甘肽混合二硫化物水平(G-SS-NP)的差異均不顯著。
 

我們沒有看到血漿和肝臟組織中氧化損傷標(biāo)志物的顯著差異，這可能是由于測量值的巨大離散，但觀察到的變化趨勢，無論是減少還是增加，都與我們對幾乎所有選定標(biāo)志物的預(yù)期一致。我們研究結(jié)果表明，在手術(shù)過程中給氫可以大大降低機體氧化應(yīng)激水平，從而減輕嚴(yán)重的缺血-再灌注損傷。
 

我們通過組織學(xué)和生化檢查以及氧化損傷標(biāo)志物的檢測，證實了2%分子氫吸入對家豬大肝切除的積極抗氧化作用。我們證明了這種方法是安全的，沒有任何已知的副作用，易于使用，可以很容易地轉(zhuǎn)化為人類醫(yī)學(xué)。
 

在本實驗研究中，我們證明了在肝臟大切除過程中吸入氫氣可以顯著降低肝臟缺血再灌注損傷相關(guān)的氧化應(yīng)激水平，從而保護肝臟實質(zhì)免受其負面影響。我們通過組織學(xué)切片和直接測定機體氧化應(yīng)激水平證實了這一現(xiàn)象。此外，我們推測GMT水平可以作為術(shù)后早期缺血-再灌注損傷的預(yù)測因素，從而可以預(yù)測肝移植術(shù)后患者發(fā)生肝衰竭的風(fēng)險。
 

上內(nèi)容摘自《孫學(xué)軍 氫思語》，僅限于知識科普，不代表對本公司產(chǎn)品的宣傳。