吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠哮喘和睡眠功能的影響支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分共同引起的慢性氣道炎癥疾病，其發(fā)生發(fā)展主要與呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1]。
 

（許多人可能認(rèn)為哮喘就是哮喘發(fā)作，其實(shí)哮喘是一種慢性病，或者是慢性炎癥疾病。氫氣抗炎癥角度，對(duì)哮喘應(yīng)該有比較好的改善效果，特別是能進(jìn)行吸入改善，這對(duì)于氣道炎癥來說，是非?？少F的改善方法。另外，氫氣由于密度小，對(duì)氣道狹窄的哮喘來說，也具有對(duì)癥改善意義）。
 

哮喘目前尚無法根治，臨床多采用控制藥物或緩解藥物進(jìn)行改善，包括糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿能藥物以及抗IgE抗體等，但均存在各種藥物不良反應(yīng)[2]。
 

隨著氫氣醫(yī)學(xué)的發(fā)展，氫氣對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的作用得到了廣泛研究[3]。2015年，張寧等[4]發(fā)現(xiàn)吸入660 mL/L高濃度氫氣對(duì)支氣管哮喘大鼠有明顯改善作用。2019年，黃等[5]發(fā)現(xiàn)吸入420 mL/L高濃度氫氣對(duì)支氣管哮喘小鼠也有明顯改善作用。這些研究提示氫氣對(duì)哮喘可能具有明顯療效。然而富含氫的生理鹽水制備過程繁瑣、使用不便，而高濃度氫氣的使用危險(xiǎn)性又大[6]。因此，探究吸入低濃度氫氣對(duì)哮喘小鼠是否有改善作用意義重大。睡眠障礙在哮喘患者中普遍存在，睡眠質(zhì)量差不僅加重病情，而且給患者的生活和工作帶來不便，嚴(yán)重影響患者身心健康[7]。目前常用的睡眠改善包括認(rèn)知行為改善（CBT-I）和鎮(zhèn)靜催眠藥物，但CBT-I干預(yù)即刻效應(yīng)差，長(zhǎng)期反復(fù)使用藥物容易使機(jī)體出現(xiàn)藥物耐受性[8]。2013年，MATSUMOTO等[9]發(fā)現(xiàn)小鼠飲用富含氫的水能增加具有神經(jīng)保護(hù)作用的胃饑餓素分泌。2018年，MIZUNL等[10]一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)飲用氫水可以改善自主神經(jīng)系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)情緒和焦慮，提高受試者的生活質(zhì)量。然而吸入低濃度氫氣對(duì)睡眠功能的影響目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。
 

本實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)吸入24～26 mL/L低濃度氫氣改善卵清蛋白（ovalbumin,OVA）誘導(dǎo)的小鼠哮喘，觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變，檢測(cè)肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid, BALF）中白細(xì)胞介素（interleukin, IL）-4、IL-13、干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）的水平和肺組織丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量和超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性，探索低濃度氫氣對(duì)哮喘小鼠的改善效果與潛在機(jī)制。同時(shí)通過觀察吸入低濃度氫氣對(duì)給予戊巴比妥鈉小鼠睡眠功能的影響，初步探索氫氣對(duì)睡眠功能的改善作用。
 

1材料和方法

 

1.1主要儀器與試劑

 

OVA（北京索萊寶公司），佐劑氫氧化鋁（成都科隆公司），戊巴比妥鈉（德國(guó)Merck公司），地西泮注射液（上海旭東海普藥業(yè)公司，批號(hào)AH181001），小鼠IL-4、IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒（深圳市達(dá)科為公司），小鼠IL-13ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢優(yōu)爾生公司），小鼠MDA、SOD、GSH檢測(cè)試劑盒（南京建成生物公司）。QMK-98500Y氫美康醫(yī)用氫氣改善儀和QMK-SY3動(dòng)物霧化致敏箱（深圳市量子氫生物技術(shù)有限公司），403T壓縮空氣式霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），TCL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀公司），Varioskan LUX酶標(biāo)儀（賽默飛科技中國(guó)公司）。
 

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

 

SPF級(jí)BALB/c小鼠和ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由成都市達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南（GB/T 35892 2018）》要求。
 

1.3吸入低濃度氫氣對(duì)OVA誘導(dǎo)小鼠哮喘的影響

 

1.3.1哮喘模型建立與氫氣改善方法　35只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組和氫氣改善組，雌雄各半，每組11～12只。第1、7、14天，哮喘模型組和氫氣改善組小鼠腹腔注射200 μLOVA混懸液（100 μg OVA，2mg佐劑氫氧化鋁），此為致敏階段，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等量PBS溶液。第21天開始將每組小鼠置于自制霧化吸入箱內(nèi)，每天上午霧化吸入50 g/L OVA，30 min，此為激發(fā)階段，正常對(duì)照組小鼠霧化吸入等量PBS溶液。同時(shí)氫氣改善組小鼠每天下午吸入24～26mL/L氫氣30 min，連續(xù)7 d，正常對(duì)照組和哮喘模型組小鼠在相同條件下吸入空氣，最后一次OVA激發(fā)改善后24 h取材。
 

1.3.2 BALF和肺組織標(biāo)本的采集　小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后打開胸腔并結(jié)扎左肺，通過無菌注射器經(jīng)氣管注入1 mL 0.01 mol/L PBS，停留10s后慢慢抽出，重復(fù)一次。將兩次取得的肺泡灌洗液于4 ℃、3 000×g離心15 min，小心吸取上清液−80℃保存待用。取左肺置入16 g/L甲醛溶液中固定，后續(xù)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色。右肺組織精確稱重后，加入9倍體積的滅菌生理鹽水充分勻漿，4 ℃、3 000×g離心10 min，小心吸取上清−80℃保存待用。
 

1.3.3 BALF中細(xì)胞因子測(cè)定　取適量BALF冰上溶解，ELISA法檢測(cè)IL-4、IL-13、IFN-γ的質(zhì)量濃度，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。
 

1.3.4肺組織勻漿中氧化性指標(biāo)測(cè)定　取適量肺組織勻漿冰上溶解，比色法檢測(cè)MDA、GSH含量以及SOD活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。
 

1.3.5肺組織形態(tài)學(xué)觀察　左肺組織石蠟切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變。
 

1.4吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠睡眠的影響

 

1.4.1吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠睡眠時(shí)間的影響　SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，稱重后隨機(jī)分為空白對(duì)照組，氫氣改善1 d、3d、5 d組和地西泮組，每組10只?？瞻讓?duì)照組和地西泮組每日上午和下午兩次分別吸入空氣，氫氣改善組每日上午和下午兩次分別吸入24～26 mL/L氫氣，每次30 min；地西泮組在第5天腹腔注射地西泮2.5mg/kg?？瞻讓?duì)照組和氫氣改善組末次空氣或氫氣吸入結(jié)束后、地西泮組給藥間隔1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉閾上劑量（使100%小鼠入睡的最低劑量，預(yù)實(shí)驗(yàn)為60 mg/kg）。觀察30 min內(nèi)各組動(dòng)物入睡情況，計(jì)算睡眠潛伏期與睡眠時(shí)間（當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí)，超過60 s不能翻正判定為翻正反射消失，即小鼠睡眠；翻正反射恢復(fù)即為小鼠覺醒）。
 

1.4.2吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠睡眠發(fā)生率的影響　小鼠分組與給藥同1.4.1?？瞻讓?duì)照組和氫氣改善組末次空氣或氫氣吸入結(jié)束后、地西泮組給藥間隔1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉閾下劑量（使90%～100%小鼠翻正反射不消失的最高劑量，預(yù)實(shí)驗(yàn)為40 mg/kg）。觀察30 min內(nèi)各組動(dòng)物入睡情況，計(jì)算各組小鼠睡眠發(fā)生率（入睡動(dòng)物只數(shù)/每組動(dòng)物數(shù)× 100%）。
 

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
 

計(jì)量資料以x¯ _s表示，組間差異比較采用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間差異比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 

2結(jié)果
 

2.1吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠哮喘的影響
 

2.1.1 BALF中炎癥細(xì)胞因子水平變化
 

與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組小鼠BALF中IL-4和IL-13質(zhì)量濃度增加（P<0.05），IFN –γ質(zhì)量濃度降低（P<0.001）。與哮喘模型組相比，氫氣改善組小鼠BALF中IL-4和IL-13質(zhì)量濃度均有所降低（P<0.05），IFN –γ質(zhì)量濃度增加（P<0.05）。見圖1。

 

2.1.2肺組織勻漿中氧化性指標(biāo)的變化
 

與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組小鼠肺組織中GSH含量降低（P<0.05），S O D活性有降低趨勢(shì)（P > 0 . 0 5），M D A含量升高（P<0.01）；與哮喘模型組相比，氫氣改善組小鼠肺組織中GSH含量增加（P<0.01），SOD活性增加（P<0.05），MDA含量有降低趨勢(shì)（P>0.05）。見圖2。2.1.3肺組織形態(tài)學(xué)觀察　HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，哮喘模型組小鼠肺泡組織塌陷變形，肺泡壁斷裂融合為肺大瘡，伴隨大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而氫氣改善組小鼠肺泡損傷較輕，肺泡壁變薄，有較少程度的肺泡壁斷裂，伴隨較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖3。
 

2.2吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠睡眠的影響
 

2.2.1對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響　
 

與空白對(duì)照組比較，地西泮組和各氫氣改善組小鼠睡眠潛伏期均縮短（P<0.05），睡眠時(shí)間均延長(zhǎng)（P<0.001）。各氫氣改善組小鼠睡眠潛伏期均長(zhǎng)于地西泮組（P<0.001），而睡眠時(shí)間均短于地西泮組（P<0.001）。各氫氣改善組間比較，僅1 d和3 d組間睡眠潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。
 

2.2.2對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響　
 

與空白對(duì)照組（20%，2/10）比較，地西泮組小鼠睡眠發(fā)生率（100%）增加（P<0.001）；氫氣吸入1 d（80%，8/10）和5 d組（80%，8/10）小鼠睡眠發(fā)生率增加（P<0.01）；氫氣改善3 d組睡眠發(fā)生率（60%，6/10）有增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與地西泮組比較，氫氣改善1 d和5 d組睡眠發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但氫氣改善3 d組睡眠發(fā)生率低于地西泮組（P<0.05）。各氫氣改善組組間比較睡眠發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 

3討論
 

氫氣是一種無色無味的氣體，內(nèi)源性氫氣主要由腸道菌群產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物學(xué)作用[11]，同時(shí)氫氣穿透力強(qiáng)，擴(kuò)散快，能快速到達(dá)病灶部位，在膿毒血癥、腦缺血和腫瘤等疾病的改善中得到廣泛研究[12-13]。外源氫氣補(bǔ)給的方法多種多樣，主要包括呼吸道吸入氫氣、飽和氫鹽水溶液注射、氫水溶液透析等[14]。目前尚無氫氣改善后不良反應(yīng)報(bào)道，表明氫氣具有極高的安全性。
 

本研究采用QMK-98500Y醫(yī)用氫氣改善儀通過電解純水制備氫氣，產(chǎn)生的氫氣與空氣混合形成24～26 mL/L低濃度氫氣，以探索低濃度氫氣對(duì)小鼠哮喘和睡眠功能的影響。哮喘實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變明顯，肺泡組織塌陷，并伴隨大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而氫氣改善組小鼠肺泡組織損傷較輕，炎性細(xì)胞較少。研究報(bào)道Th1/Th2細(xì)胞失衡及其引起的后續(xù)病理變化是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的重要原因。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-13等細(xì)胞因子，正向調(diào)節(jié)免疫功能，其水平與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)[15]。IL-4是誘導(dǎo)炎癥的初始因素，其不僅能促進(jìn)IgE生成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮黏附因子表達(dá)，進(jìn)而募集淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致氣道炎癥，還能抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能[16]。IFN-γ具有拮抗IL-4的作用，可通過糾正Th1/Th2細(xì)胞失衡，緩解哮喘癥狀[17]。
 

本研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型小鼠BALF中IL-4、IL-13質(zhì)量濃度增加，IFN-γ質(zhì)量濃度降低，即哮喘模型小鼠呼吸系統(tǒng)Th1/Th2細(xì)胞失衡，Th2細(xì)胞免疫亢進(jìn)。吸入低濃度氫氣后，與哮喘模型組相比，BALF中IL-4、IL-13質(zhì)量濃度降低，IFN-γ質(zhì)量濃度增加，表明吸入低濃度氫氣通過糾正哮喘小鼠Th1/Th2細(xì)胞失衡，減輕炎癥反應(yīng)。此外，研究顯示哮喘的發(fā)病機(jī)制與呼吸道系統(tǒng)的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[18]。生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生與清除保持穩(wěn)定，這種穩(wěn)態(tài)主要通過GSH和SOD的抗氧化系統(tǒng)作用維持[19]。研究表明，哮喘患者呼吸道系統(tǒng)的炎性細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，同時(shí)GSH含量與SOD活性顯著降低、氧自由基清除減少，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA等氧化損傷相關(guān)指標(biāo)水平增加[2 0]。在本研究中，OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織中GSH含量明顯降低、SOD活性輕度降低、MDA水平顯著升高，這表明哮喘模型小鼠肺部的氧化應(yīng)激水平明顯增強(qiáng)。
 

吸入低濃度氫氣后，與哮喘模型組相比，氫氣改善組小鼠肺組織中抗氧化劑SOD活性和GSH含量得到恢復(fù)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量稍有降低，表明吸入低濃度的氫氣能降低哮喘小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平。睡眠作為我們最熟悉的生命活動(dòng)之一，對(duì)維持正常學(xué)習(xí)、工作和生活具有非常重要的意義。睡眠質(zhì)量差、睡眠剝奪不僅影響正常生理活動(dòng)，還將引發(fā)心理和行為活動(dòng)的異常[21]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，氫氣吸入對(duì)改善睡眠有作用，特別是在晚期癌癥患者中效果尤為明顯。然而，目前尚無任何研究證據(jù)表明氫氣對(duì)睡眠功能的改善作用。
 

本研究結(jié)果顯示連續(xù)吸入低濃度氫氣1 d、3 d或5 d均可明顯縮短閾上劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠的潛伏期、延長(zhǎng)其睡眠時(shí)間；同時(shí)氫氣吸入1 d或連續(xù)吸入5 d均可明顯提高閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠的睡眠發(fā)生率，以上結(jié)果表明低濃度氫氣吸入對(duì)戊巴比妥鈉促進(jìn)小鼠睡眠有一定協(xié)同作用。
 

研究還發(fā)現(xiàn)吸入低濃度氫氣對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的縮短與睡眠時(shí)間的延長(zhǎng)作用均明顯弱于地西泮陽性對(duì)照藥，吸入3 d對(duì)睡眠潛伏期的影響小于吸入1 d和5 d組；吸入1 d或5 d對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的改善作用與地西泮未見明顯差異，各氫氣改善組之間也未見明顯差異，而氫氣吸入3 d睡眠發(fā)生率較對(duì)照組有增加但不及地西泮，以上結(jié)果可能與氫氣在小鼠體內(nèi)停留時(shí)間以及個(gè)體差異有關(guān)。
 

上述結(jié)果表明，吸入低濃度氫氣對(duì)小鼠睡眠功能的影響不及地西泮，但誘導(dǎo)睡眠發(fā)生率的效果與地西泮相似，因此吸入低濃度氫氣可能是一種溫和的改善睡眠的方法，其作用機(jī)制也需要進(jìn)一步探索。綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)吸入低濃度的氫氣后能改善哮喘小鼠肺組織損傷、炎癥損傷和氧化損傷，同時(shí)可以改善小鼠的睡眠功能。低濃度氫氣具有安全性高、容易獲取、價(jià)格低廉、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，為未來臨床改善哮喘和睡眠障礙提供一種新的策略。
 

上內(nèi)容摘自《孫學(xué)軍 氫思語》，僅限于知識(shí)科普，不代表對(duì)本公司產(chǎn)品的宣傳。