研究背景和目的： 肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion I/R)損傷是缺血的肝組織恢復(fù)血供后使肝臟缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象,涉及自由基產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性介質(zhì)大量釋放等一系列病理生理過(guò)程。由于肝臟外科手術(shù)經(jīng)常需要阻斷肝門(mén),不可避免的會(huì)造成肝臟I/R,從而加重術(shù)后肝功能損傷甚至導(dǎo)致肝臟衰竭。許多研究表明氧化應(yīng)激在缺血再灌注肝損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著重要的作用,抑制氧自由基的產(chǎn)生或通過(guò)生化反應(yīng)清除氧自由基可以有效減輕肝損傷。 在生理情況下,生物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生與被清除,維持在一個(gè)穩(wěn)定水平上。如果自由基的產(chǎn)生與清除失衡,則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)氫氣有選擇性抗氧化作用,能夠有選擇性地清除亞硝酸陰離子和羥自由基。第二軍醫(yī)大學(xué)孫學(xué)軍教授課題組通過(guò)高壓將氫氣溶解于生理鹽水中成功制備了氫生理鹽水并申請(qǐng)了專利,這項(xiàng)技術(shù)可以使氫分子的研究更加標(biāo)準(zhǔn)化,介于缺血再灌注肝損傷機(jī)制和氫生理鹽水獨(dú)特的選擇性抗氧化性質(zhì),本課題以大鼠肝缺血再灌注損傷為模型,擬驗(yàn)證氫生理鹽水對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并初步探討其作用的機(jī)制。 研究方法 1.通過(guò)無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉肝中葉和左葉的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈,使約70%的肝臟缺血,90min后去除血管夾,恢復(fù)肝血流180min建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型,再灌注180min后收集血漿及肝臟標(biāo)本。 2.HE染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.運(yùn)用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能。 4.比色法檢測(cè)肝組織中MDA、SOD、GSH含量,觀察肝組織氧化反應(yīng)程度。 5.ELISA法檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HM(GB1活性觀察肝組織炎性反應(yīng)程度。 6.差速離心法分離肝細(xì)胞線粒體及胞漿。 7.透射電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體改變。 8.比色法檢測(cè)線粒體中MDA、GSH、GSSG含量,觀察線粒體氧化反應(yīng)程度。 9.熒光分光光度計(jì)檢測(cè)線粒體ATP變化,Clark氧電極法檢測(cè)線粒體呼吸功能,觀察線粒體損傷情況。
結(jié)果 (一)氫生理鹽水能使I/R誘導(dǎo)的肝損傷明顯減輕。 1.氫生理鹽水組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平明顯低于生理鹽水對(duì)照組。 2.HE檢測(cè)顯示氫生理鹽水組損傷后肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)好于生理鹽水對(duì)照組,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)少于生理鹽水對(duì)照組。 (二)氫生理鹽水能有效抑制缺血再灌注肝組織氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng) 1.氫生理鹽水組肝組織MDA水平明顯低于生理鹽水對(duì)照組,而SOD活力、GSH含量明顯高于生理鹽水對(duì)照組。 2.氫生理鹽水組肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1活性明顯低于生理鹽水對(duì)照組。 (三)氫生理鹽水能明顯減輕I/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷和氧化反應(yīng) 1.氫生理鹽水組線粒體中MDA、GSSG水平低于生理鹽水對(duì)照組,而GSH含量則高于生理鹽水對(duì)照組。 2.氫生理鹽水組線粒體ATP含量高于生理鹽水對(duì)照組,氫生理鹽水能顯著提高線粒體呼吸控制率及磷氧比,改善線粒體呼吸功能。 結(jié)論 本課題以大鼠肝缺血再灌注損傷模型為研究對(duì)象,驗(yàn)證氫生理鹽水對(duì)肝臟缺血再灌注肝功能損傷的保護(hù)作用并初步探討其作用的可能機(jī)制,得到以下結(jié)論： 一、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷。 二、氫生理鹽水能有效抑制缺血再灌注肝組織氧化應(yīng)激。 三、氫生理鹽水能有效減輕缺血再灌注肝組織炎性反應(yīng)。 四、氫生理鹽水能明顯減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激。 五、氫生理鹽水能抑制肝細(xì)胞線粒體ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低來(lái)發(fā)揮肝損傷保護(hù)作用。 本論文以大鼠肝缺血再灌注損傷為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法研究了氫生理鹽水在體內(nèi)抗氧化、抑制炎性反應(yīng)、減輕肝細(xì)胞線粒體損傷的功能,初步驗(yàn)證了氫生理鹽水能有效減輕缺血再灌注肝損傷,并能抑制肝組織氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氫生理鹽水還可以減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體的氧化損傷,并通過(guò)增強(qiáng)線粒體呼吸功能發(fā)揮肝損傷保護(hù)作用,為氫生理鹽水應(yīng)用于臨床治療缺血再灌注肝損傷提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。
