目的本文以乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231為實(shí)驗(yàn)材料,建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腫瘤炎性微環(huán)境體外模型,檢測氫分子對乳腺癌炎性微環(huán)境的影響,初步探討氫分子抑制腫瘤炎性微環(huán)境的內(nèi)在分子機(jī)理;同時(shí)建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,觀察氫氣對裸鼠成瘤性的影響,為氫分子的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法1.體外培養(yǎng)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株,制備經(jīng)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基。接種對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞于6孔板中,分別設(shè)置正常培養(yǎng)基空白對照組、條件培養(yǎng)基處理組、條件培養(yǎng)基+高純度飽和氫氣處理6 h組和處理12 h組。免疫印跡檢測氫分子對MDA-MB-231細(xì)胞炎性炎性相關(guān)蛋白p-STAT3和COX-2表達(dá)水平的影響,觀察氫分子對MAPK激酶信號通路關(guān)鍵因子及其下游靶蛋白CREB的影響;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測氫分子對白細(xì)胞介素6(IL-6)分泌表達(dá)的影響。2.體外培養(yǎng)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞,并接種于6孔板中,隨機(jī)分為兩組:即空白對照組和氫分子處理組。空白對照組加L-15完全培養(yǎng)基,氫分子加高純度氫氣飽和的L-15培養(yǎng)基。免疫印跡法檢測兩組中自噬相關(guān)蛋白LC3-II和Beclin-1表達(dá)水平的變化,體外小管形成實(shí)驗(yàn)觀察氫分子對血管生成的影響,同時(shí)檢測血管生成因子VEGF表達(dá)水平的變化。3.選擇Bal b/c純系裸鼠10只,皮下注射人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞建立裸鼠腫瘤模型,并隨機(jī)分為氧氣+氫氣組、氧氣+氮?dú)饨M兩組(n=5)。自接種日起,分別吸入氫氧及氮氧混合氣體,每次1h,持續(xù)30d。完整取出腫瘤,測量腫瘤大小。Western Blot檢測p-STAT3、COX-2、CREB及PPAR-γ等炎性因子的表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織中p-STAT3和COX-2的表達(dá)。
結(jié)果1.氫分子抑制乳腺癌細(xì)胞炎性相關(guān)因子的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中p-STAT3及COX-2的蛋白表達(dá),而氫分子能夠顯著抑制條件培養(yǎng)基對p-STAT3與COX-2的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)基處理后,JNK的磷酸化水平下降,氫分子可以顯著拮抗條件培養(yǎng)基對JNK活性的抑制作用;同時(shí),氫分子下調(diào)MAPK下游靶蛋白CREB的表達(dá)。另外,氫分子能夠抑制乳腺癌細(xì)胞中IL-6的分泌表達(dá)。2.氫分子對乳腺癌細(xì)胞自噬的抑制作用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn),氫分子處理MDA-MB-231細(xì)胞24h后,LC3-II/LC3-I比值顯著降低(P<0.05),表明氫分子能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬。3.氫氣對乳腺癌移植瘤的影響氫氣干預(yù)組腫瘤體積、重量均無顯著變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,氫氣可抑制COX-2、p-STAT3的表達(dá),說明氫氣干預(yù)后的裸鼠乳腺癌細(xì)胞的增殖能力減弱;免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn),氫氣能夠抑制裸鼠乳腺癌COX-2、CREB、PPAR-γ及p-STAT3蛋白的表達(dá)。結(jié)論1.氫分子能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞腫瘤微環(huán)境中炎性因子的分泌表達(dá);同時(shí)有效抑制細(xì)胞自噬水平。2.氫分子能夠抑制裸鼠移植瘤中炎性因子的表達(dá),氫分子不能夠直接抑制體內(nèi)腫瘤的生長。
