視網膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一類可遺傳的視網膜退行性病變(retinal degeneration,RD),以進行性視網膜感光細胞的死亡、視野缺損和視力喪失為特征。目前,全球RP患病率約為1/3000～1/7000。由于RP的遺傳學機制復雜,使得該病的具體發(fā)病機制尚未完全明確,且缺乏有效的防治措施。一般認為感光細胞的凋亡是RP的共同終末途徑,而活性氧(reactive oxygen species,ROS)則被認為是RP發(fā)病過程感光細胞凋亡的重要促成因素。氫分子是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種可選擇性清除ROS的抗氧化劑。文獻和我們前期的研究發(fā)現(xiàn)氫分子可通過抗氧化損傷、調節(jié)凋亡、減輕炎癥等通路對眼內炎、白內障及視網膜光損傷等眼疾起到保護作用。據(jù)此,我們提出研究假說:氫分子對RP視網膜損傷具有保護作用。為了驗證研究假說,我們選擇N-甲基-N-亞硝基脲(N-Methyl-N-nitrosourea,MNU)誘導RP大鼠模型進行研究。該動物模型具有造?？臁⒖芍貜托愿叩葍?yōu)點,是一種常用于RP發(fā)病機制和防治措施研究的動物模型。但是,以往的研究僅對該模型的病程時間特征進行研究,而很少涉及該模型視網膜變性的空間特征(如:視網膜變性在中央部與周邊部是否存在差異?鼻側與顳側是否存在差異?上側與下側是否存在差異?外層視網膜變性的同時,內層視網膜是否也發(fā)生病變?視網膜不同神經環(huán)路的病變是否一致?)。本研究旨在深入研究mnu誘導的rp大鼠視網膜病變時空特點的基礎上,驗證氫分子對該模型視網膜功能和結構的保護作用,并從抗氧化和抗凋亡角度初步探索其保護機制。本研究將對mnu誘導rp動物模型的發(fā)病機制理論進行補充,并為rp的防治提供新思路,同時也為氫分子制劑的臨床應用轉化提供一定的實驗依據(jù)。材料與方法實驗一:mnu誘導rp大鼠視網膜時空特點評估將90只sd大鼠隨機等分5個組:1個對照組和4個mnu干預組。其中各mnu干預組大鼠僅接受1次腹腔注射mnu,劑量為60mg/kg,而對照組腹腔注射等量的生理鹽水。四個mnu干預組分別在干預后第一天(p1)、p3、p5、p7天進行各項指標的檢測。(1)利用視網膜電圖(electroretinogram,erg)從在體水平觀察mnu誘導rp大鼠視網膜功能隨病程變化的特點;(2)利用多電極陣列(multielectrodearray,mea)從離體水平觀察該模型大鼠不同局部(中央/周邊、鼻側/顳側、上側/下側)視網膜的功能;(3)利用光學相干斷層掃描(opticalcoherencetomography,oct)從在體水平觀察該模型大鼠視網膜結構隨病程變化的特點;(4)利用視網膜石蠟切片he染色從離體水平觀察該模型大鼠不同局部視網膜的組織結構;(5)利用視網膜鋪片免疫熒光染色觀察該模型大鼠不同局部視網膜感光細胞的存活情況;(6)利用westernblotting檢測該模型大鼠視網膜視桿細胞和視錐細胞的存活情況。(7)利用定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qrt-pcr)檢測促凋亡基因bax、calpain2、caspase3和抗凋亡基因bcl2的表達情況。
實驗二:氫飽和生理鹽水對mnu誘導rp大鼠視網膜保護作用的研究將96只sd大鼠隨機等分4個組:正常對照組(normalcontrol,nc)、氫飽和生理鹽水(hydrogen-richsaline,hrs)對照組、生理鹽水干預組(mnu+生理鹽水)和hrs干預組(mnu+hrs)。mnu的給藥方式及劑量同實驗一。hrs和生理鹽水的干預方式均為腹腔注射,劑量為10ml/kg/d,于mnu造模前14天開始干預。在mnu造模后第三天(p3)和第七天(p7)天進行各項指標的檢測。(1)利用erg和mea場電位從外層視網膜細胞功能角度觀察hrs的保護作用;(2)利用mea記錄視網膜神經節(jié)細胞(retinalganglioncells,rgcs)放電情況,從內層視網膜細胞功能角度觀察hrs的保護作用;(3)利用視網膜石蠟切片he染色從形態(tài)學角度觀察hrs的保護作用;(4)利用視網膜切片tunel染色和qrt-pcr檢測凋亡相關基因bax、calpain2、caspase3、bcl2的表達情況,從抗凋亡角度研究hrs保護作用機制;(5)利用羥胺法測定視網膜總超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,t-sod)活性和硫代巴比妥酸法測定視網膜丙二醛(malondialdehyde,mda)含量,從抗氧化角度研究hrs保護作用機制。結果1.大鼠腹腔單次注射60mg/kg的mnu后,視網膜病變表現(xiàn)出以下幾個時空特點:(1)mnu干預一周內病變逐漸加重。erg反應及mea場電位反應幅值均逐漸降低,到p7時,幾乎都表現(xiàn)為熄滅型反應。oct和he染色測量視網膜外核層(outernuclearlayer,onl)層厚度結果也顯示,onl層厚度逐漸變薄,到p7時,onl層細胞基本消失。(2)感光細胞凋亡高峰發(fā)生在p3。qrt-pcr檢測結果顯示,促凋亡基因bax、calpain2和caspase3在p3時表達上調達到峰值,同時抗凋亡基因bcl2的表達也在p3時達到最大程度的下調。(3)病變遵循視桿細胞→視錐細胞的規(guī)律。反映視錐細胞功能的明視erg反應幅值下降(p3)要晚于反映視桿細胞功能的暗視erg反應。視網膜鋪片感光細胞熒光染色及視桿細胞/視錐細胞特異蛋白westernblotting檢測結果也顯示,病變早期視桿細胞丟失程度要重于視錐細胞。(4)病變遵循中央部→周邊部的規(guī)律。mea場電位結果顯示,中央部幅值下降最早,隨后發(fā)展到近周部,最后累及周邊部。he染色onl層厚度變薄也表現(xiàn)出這一順序。(5)病變遵循鼻下→鼻上、顳下→顳上的規(guī)律。mea場電位分象限分析結果顯示,視網膜鼻下象限幅值最早發(fā)生下降,隨后是鼻上和顳下,最后發(fā)展到顳上象限。視網膜鋪片感光細胞熒光染色及qrt-pcr檢測視網膜各個象限凋亡水平結果也表現(xiàn)出這一特點。(6)病變遵循on通路→off通路的規(guī)律。mea記錄rgcs光誘發(fā)放電結果顯示,on型反應的放電頻率明顯下降發(fā)生在p3,要早于off型反應(p5),病變早期光誘發(fā)rgcs總反應下降與on通路病變密切相關。2.hrs對mnu誘導rp大鼠視網膜具有保護作用。在功能學和形態(tài)學方面均可見其保護作用:(1)功能學保護作用:hrs干預組較生理鹽水干預組而言,其明視erg、暗視erg及mea場電位幅值均明顯改善,表明hrs對外層視網膜細胞功能有保護作用。而mea記錄rgcs動作電位結果則顯示,hrs可有效降低mnu引起的rgcs自發(fā)放電頻率,提高其對有效視覺信息的反應,表明hrs對內層視網膜細胞功能及視覺通路的完整性也具有保護作用。(2)形態(tài)學保護作用:he染色測量視網膜onl層厚度,發(fā)現(xiàn)hrs可有效延緩onl層細胞的丟失。3.hrs的這種保護作用無視網膜區(qū)域性差異。mea場電位結果及he染色結果均顯示,hrs對中央部、近周部和周邊部的視網膜功能和結構均有保護作用,無區(qū)域性差異。4.hrs對mnu誘導rp大鼠視網膜保護作用與抗氧化相關。hrs干預組較生理鹽水干預組而言,視網膜t-sod活性升高,mda含量下降。5.hrs對mnu誘導rp大鼠視網膜保護作用與抗凋亡相關。tunel染色和qrt-pcr結果顯示,hrs可以有效降低視網膜組織的凋亡水平,減少視網膜細胞因凋亡而導致的丟失。6.hrs對正常大鼠視網膜結構及功能無不良影響。hrs對照組與正常對照組在各項功能學和形態(tài)學檢查中,均無統(tǒng)計學差異。
結論1.單次腹腔注射60mg/kg的mnu誘發(fā)的rp大鼠視網膜病變存在特定的時間和空間特點。因此,在利用該模型進行rp相關研究時,應選擇合適的時間點進行研究,并選擇合適的、統(tǒng)一的病變區(qū)域進行檢測,以達到更加精準的研究目的。2.hrs對mnu誘發(fā)rp大鼠的視網膜具有保護作用,可以有效延緩視網膜病變的發(fā)展。其保護作用與抗氧化和抗凋亡機制相關。3.HRS對正常視網膜功能及結構無不良影響,對生物體的安全性較高,具備向臨床應用轉化的潛質。
