第一部分氫氣干預(yù)肺癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析目的:探究氫氣干預(yù)對(duì)肺癌細(xì)胞A549蛋白表達(dá)水平的影響,以探究氫氣抑制肺癌進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制。方法:將A549細(xì)胞分為2組,對(duì)照組和60%氫氣組,每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。氫氣處理72 h后收集蛋白,對(duì)兩組A549細(xì)胞中提取的蛋白進(jìn)行非標(biāo)記定量蛋白組測(cè)序確定2組差異表達(dá)蛋白,隨后對(duì)照這些差異蛋白進(jìn)行基因本體(Gene Ontology)、KEGG pathway和蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction)分析。此外,選取肺癌A549和H1975細(xì)胞,均分為對(duì)照組和60%氫氣處理組,分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白免疫印跡技術(shù)(western blotting)檢測(cè)2組細(xì)胞中CD47 m RNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果:1.較對(duì)照組相比,氫氣處理可造成58個(gè)蛋白表達(dá)差異,其中包含35個(gè)上調(diào)蛋白,23個(gè)下調(diào)蛋白;2.58個(gè)差異表達(dá)的蛋白功能主要富集在“ribonucleoprotein complex biogenesis(核糖核蛋白復(fù)雜生物起源)”、“regulation of muscle system process(肌肉調(diào)節(jié))”和“regulation of hypoxia-induced intrinsic apoptotic signaling pathway(調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的凋亡通路)”、“ion channel binding(離子通道綁定)”、“U6 sn RNA binding”和“calcium channel inhibitor activity(鈣通道抑制劑活性)”、“MICOS complex”和“myofibril(肌原纖維)”條目;3.氫氣處理能顯著下調(diào)CD47蛋白和m RNA的表達(dá),這可能是氫氣抑制肺癌進(jìn)展的可能途徑。小結(jié):氫氣處理可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中58個(gè)蛋白差異表達(dá),其中包含CD47,且經(jīng)western blotting和q RT-PCR驗(yàn)證。此結(jié)果表明CD47可能是氫氣抑制肺癌進(jìn)展的一種途徑。第二部分氫氣通過(guò)調(diào)控CD47/CDC42通路抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲及免疫逃避目的:通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究CD47/CDC42是否參與了氫氣誘導(dǎo)的肺癌進(jìn)展抑制。方法:肺癌A549和H1975兩株細(xì)胞被用作此部分實(shí)驗(yàn);采用細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的手段上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞中CD47的表達(dá)水平;氫氣/CD47對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡的影響分別通過(guò)CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);western blotting實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase3、cleaved caspase3、PARP、cleaved PARP及CD47和CDC42蛋白表達(dá)水平的影響;體外巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)用來(lái)評(píng)估氫氣對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。

結(jié)果:1.氫氣干預(yù)可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;2.CD47敲除可協(xié)同氫氣處理共同抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;3.CD47過(guò)表達(dá)可顯著削弱氫氣的抗腫瘤作用;4.氫氣干預(yù)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的吞噬作用。小結(jié):氫氣干預(yù)可通過(guò)下調(diào)CD47的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時(shí)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬。第三部分氫氣抑制肺癌生長(zhǎng)及CD47、CDC42表達(dá)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)康?體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究氫氣處理對(duì)肺癌腫瘤病理學(xué)變化的影響及CD47和CDC42表達(dá)的影響。方法:荷瘤小鼠分為對(duì)照組10只、氫氣組10只和順鉑組10只,收集各組小鼠腫瘤組織,分別通過(guò)伊紅-蘇木精染色(Hematoxylin&eosin,HE)和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)(Immunohistochemical stainin,IHC)評(píng)估各組小鼠腫瘤組織的病理學(xué)狀態(tài)及CD47和CDC42蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.氫氣干預(yù)同順鉑治療效果一致,均可明顯緩解腫瘤組織細(xì)胞異質(zhì)。2.氫氣干預(yù)可明顯降低荷瘤小鼠腫瘤組織中CD47和CDC42的表達(dá)水平。小結(jié):本部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明氫氣干預(yù)可通過(guò)降低CD47/CDC42的表達(dá)抑制肺癌進(jìn)展。氫氣或許有望成為CD47蛋白高表達(dá)的肺癌患者的有效治療方法。結(jié)論:1.氫氣處理能顯著下調(diào)CD47的蛋白和m RNA的表達(dá);2.氫氣干預(yù)可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的吞噬作用;3.CD47敲除可協(xié)同氫氣處理共同抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;4.CD47過(guò)表達(dá)可顯著削弱氫氣的抗腫瘤作用;5.氫氣干預(yù)同順鉑治療效果一致,均可明顯緩解腫瘤組織細(xì)胞異質(zhì)。